丙型肝炎病毒（HCV）NS3/4A蛋白酶是抗HCV的主要靶标。缺乏可靠的HCV细胞培养模型, 限制了NS3/4A蛋白酶抑制剂的筛选。本项目依据NS3/4A蛋白酶的催化特性和细胞凋亡酶-3（Casp3）的活化过程，建立Tet-off和NS3/4A蛋白酶双稳定的HepG2细胞系，该细胞系在dox诱导下调控表达具有酶活性的NS3/4A蛋白；利用重叠PCR 改构Casp3基因，构建其原核表达载体，表达并纯化PTD-rCasp3融合蛋白作为底物；运用流式细胞术、TUNEL等证实PTD-rCasp3可以进入上述细胞，其活化依赖于NS3/4A蛋白酶的水解，并介导细胞凋亡；以其候选抑制剂降低细胞凋亡程度等为指标，用细胞凋亡酶活性测定和MTT法建立细胞内NS3/4A蛋白酶活性测定系统，并用商品化的抑制剂对其进行初步评价。本研究的完成将为筛选NS3/4A蛋白酶药物提供技术平台，这对于防治HCV具有重要意义。

本项目通过将HCV NS3/4A蛋白酶的活性转换为细胞凋亡酶-3的活性，以细胞凋亡及细胞死亡为指标建立了一种新型的细胞为基础的NS3/4A蛋白酶活性测定系统。（1）构建了NS3/4A丝氨酸蛋白酶表达载体，建立了组成性表达NS3/4A的稳定表达细胞克隆和可诱导表达NS3/4A丝氨酸蛋白酶的双稳定细胞系。（2）扩增了Casp3基因，构建了重组rCasp3（Casp3序列中的切割位点转换为NS3/4A丝氨酸蛋白酶识别序列），分别构建了真核表达质粒pcDNA3.1-rCasp3与原核表达了PTD-rCasp3纯化蛋白。（3）将pcDNA3.1-rCasp3转染表达NS3/4A丝氨酸蛋白酶的细胞，用透射电镜、流式细胞术测定和细胞计数等方法，证实了rCasp3的活化是依赖于NS3/4A丝氨酸蛋白酶的活性，并能够引起细胞的凋亡。（4）通过将pCDNA3.1-rCasp3转染scpHepG2细胞或PTD-rCasp3与scpHepG2细胞共同孵育两种方式，分别建立了以MTT为基础的细胞内NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性测定系统，并用商品化的NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂对建立的该细胞系统进行了验证。