导读
长久以来，神经科学领域一直缺乏一种能够在活体动物模型中、以单细胞分辨率同时解析三维微血管结构、血氧饱和度及血流动态的使能技术。近日，由圣路易斯华盛顿大学与西北大学组成的联合研究团队，提出了一种基于无标记细胞追踪的超分辨光声显微功能成像技术。该技术无需引入外源标记物，通过自主构建的基于光学谐振腔的高速光声显微成像系统对活体血管中单个红细胞的流动进行实时追踪，首次实现了单细胞分辨率的三维微血管结构与功能（血氧与血流）的全景解析。相关研究成果以 Super-resolution functional photoacoustic microscopy via label-free cell tracking 为题发表于国际顶尖光学期刊《Light: Science Applications》。圣路易斯华盛顿大学钟丰鹤博士与王卓颖博士为本文共同第一作者，胡松教授为通讯作者。
研究背景
大脑功能的正常运转依赖于神经元活动与微血管供氧之间的精细平衡。多种不同模态的生物医学光子学技术为分析大脑功能活动提供了有力支持。传统成像技术如双光子显微镜虽能实现单细胞分辨率的神经元活动成像，但在同等空间尺度上同步观测血流与血氧仍面临挑战。现有荧光成像技术虽能追踪标记的红细胞或微球，但无法测量血氧饱和度；而基于磷光染料的双光子成像虽可测量氧分压，却因成像速度较慢而难以实现三维高分辨率成像。现有技术均无法同时对氧代谢与血液动力学进行高时空分辨率的测量。
由于血红蛋白具有较高的光吸收系数，光声显微成像（PAM）已发展成为一种无需外源标记、可实现高速血氧与血流成像的重要工具。然而，受限于超声信号与换能器带宽，传统光声显微成像的轴向分辨率远低于横向分辨率，导致空间分辨率存在明显的各向异性问题，严重制约其在三维微血管结构与功能成像中的应用。亟需发展新的方法以突破这一长期存在的瓶颈。
研究亮点
该研究团队提出并构建了一种基于透明微环谐振腔（MRR）的高速超分辨光声显微功能成像系统。该系统结合高帧率的光学扫描与双波长激光激发，实现了对活体脑皮层微血管中单个红细胞的时空追踪及其血氧饱和度的同步成像；通过提取红细胞跨帧运动轨迹，不仅能够重建超分辨的三维微血管结构，还可同步定量血流方向与流速，从而实现超分辨光声显微功能成像（SR-fPAM）。
1. 构建高速扫描、高灵敏度和高稳定性的光声显微成像系统：实现红细胞时空追踪
研究团队构建了基于透明高品质因子的MRR的高速光声显微功能成像系统。由于MRR 兼具高探测灵敏度和宽声场覆盖能力，团队结合双波长激光激发与千赫兹级帧率的光学扫描，使系统能够连续追踪相邻B扫描帧之间单个红细胞的运动轨迹（图1）。在此基础上，研究团队进一步采用双向扫描策略，沿两个正交方向采集 B扫描序列，经矢量合成实现三维血流速度的定量重建，为微血管血流动力学研究提供了新的技术维度。
图1｜微环谐振腔（MRR）与千赫兹帧率的红细胞追踪。（a）超声扰动引起的 MRR 透射谱偏移。（b）MRR 在不同横向与轴向位置下的超声探测灵敏度分布。（c）MRR 在成像过程中的稳定性评估。（d）相邻B扫描帧之间红细胞的追踪结果。比例尺：50 微米；放大图：20微米。（e–g）基于连续红细胞追踪重建的超分辨微血管结构（e）、血流方向（f）和血流速度（g）的横截面图像。比例尺：50 微米。
2. 迈向双光子级三维分辨率：SR-fPAM 的超分辨成像能力验证
研究团队对同一小鼠脑皮层微血管分别进行了超分辨光声显微成像（SR-fPAM），传统光声显微成像（PAM）与双光子显微成像（TPM），并对图像进行对照分析。结果表明，SR-fPAM 在三维空间分辨率方面可达到与双光子显微镜相当的水平，并显著优于传统光声显微成像（图2）。
图2｜采用 PAM、SR-fPAM 和 TPM 三种成像技术对同一小鼠脑皮层微血管进行三维结构成像对比。（a）三种技术获得的微血管图像并排对比。左：传统 PAM；中：SR-fPAM；右：借助FITC 标记的 TPM。比例尺：50 微米。（b）由三种技术测得的图（a）中血管 L1 和 L2 的横截面轮廓对比。（c）传统 PAM 与SR-fPAM 重建的三维微血管图像相对于 TPM 图像的结构相似性指数（SSIM）对比。
3. 首次以单细胞分辨率观测血管脑卒中模型中血流与血氧的再分配：SR-fPAM 的活体三维功能成像能力
研究团队利用 SR-fPAM 对小鼠大脑单支小动脉闭塞后邻近区域三维微血管网络的血流与血氧进行了活体观测。得益于 SR-fPAM 所具备的三维单细胞分辨能力，研究发现，卒中不仅导致局部血流中断，还可引发侧支循环的启动与血流方向的反转。进一步结果表明，在目标血管闭塞后，邻近微血管网络发生了复杂的代偿性重构：部分下游血管出现血流方向反转并伴随流速增加，而另一些血管则表现为血流速度升高或血氧饱和度下降（图3）。上述结果直观揭示了缺血后微血管尺度下的氧合–血流动力学重分布规律，为深入理解脑卒中后侧支循环的建立及组织代偿机制提供了新的高分辨功能成像手段。
图3｜SR-fPAM对小鼠单血管脑卒中前后邻近微血管网络的三维超分辨功能成像。（a）卒中前后微血管血流方向在 X–Y 和X–Z 平面上的超分辨投影图像。比例尺：50微米。（b）卒中前后微血管血流速度在 X–Y 和X–Z 平面上的超分辨投影图像（上）及其变化情况（下）。比例尺：50 微米。（c）卒中前后微血管血氧饱和度在 X–Y 和X–Z 平面上的超分辨投影图像（上）及其变化情况（下）。比例尺：50 微米。
总结与展望
SR?fPAM首次实现了无标记、三维、单细胞分辨率的微血管结构与功能的同步成像。突破了现有光声成像技术在空间分辨率的高度各向异性以及功能信息整合方面的限制，该技术在神经科学基础研究中具有重大潜力，并有望服务于脑卒中、阿尔茨海默病等脑相关疾病的发病机制研究与药物疗效评估。
研究团队表示，下一步将推动 SR-fPAM 与双光子显微镜的集成，实现神经元活动与微血管氧合–血流动力学过程的联合观测，从而进一步揭示神经血管耦合的细胞层面机制。此外，通过引入深度学习方法提升成像速度，并结合近红外光激发以增强成像深度，该技术有望在更广泛的生物医学成像应用中发挥重要作用。（来源：LightScienceApplications微信公众号）
相关论文信息：https://doi.org/10.1038/s41377-026-02235-3
特别声明：本文转载仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本网站观点或证实其内容的真实性；如其他媒体、网站或个人从本网站转载使用，须保留本网站注明的“来源”，并自负版权等法律责任；作者如果不希望被转载或者联系转载稿费等事宜，请与我们接洽。
作者：胡松等 来源：《光：科学与应用》
