乳腺癌是一种异质性较高的肿瘤，肿瘤异质性是导致治疗获益不佳的常见耐药机制之一。尽管肿瘤异质性一直受到关注和研究，但传统基于病理活检、基因组测序等方式进行肿瘤异质性评估的方法在临床应用中存在诸多障碍。近期，国际著名综合性学术期刊Science Advances(IF：13.6)在线发表的一项研究建立了大型多中心影像多组学数据库，提取高通量特征将影像转化为数字矩阵，进而关联分子特征和临床预后因素，开发了实现ITH“无创可视化”评估的新方法[1]，有望构建全面无创评估和精准靶向治疗的临床实践新模式。
研究背景
肿瘤内异质性(ITH)是指在单个肿瘤中存在多个不同亚型，且不同亚型存在动态转化，包括遗传性ITH、组织学ITH和表型ITH。ITH促进了疾病进展和治疗耐药，确定其分子驱动因素并了解对转移和耐药的影响，可能对治疗策略形成有效指导。乳腺癌中ITH的鉴定依赖于病灶多区域组织活检和基因组测序[2,3]，或根据单次活检的基因组测序进行推导[4,5]。与单次活检测序相比，多次活检测序提供了更准确和更详细的ITH信息[6]，但获得足够高质量活检组织的难度制约其临床实用性。组织学ITH是指肿瘤细胞形态的变异性，通过整个组织病理切片的细胞核大小和染色强度进行评估[7]。然而，病理切片只能反映整个肿瘤单个切片上的细胞异质性。因此，开发一种无创且全面的ITH识别方法至关重要。
研究结果
研究设计和队列概述
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本研究分为四个阶段(图1)：
通过整体增强磁共振成像(DCE-MRI)图像，将肿瘤区域划定为目标区域(ROIs)，并提取定量放射学特征，建立了三个独立的放射组学队列。
开发一种用于识别IITH不同亚型的影像学特征标志，来区分发现队列和验证队列中的不同IITH亚型，同时对IITH的预后价值进行评估和验证。
将IITH与基因组肿瘤异质性和细胞形态肿瘤异质性相关联，从多层次的异质性验证以确认IITH的可靠性。
探索高IITH且预后不良患者的分子特征和潜在治疗选择。
图1. 研究示意图
本研究建立了一个包含三个独立数据集的大型多中心乳腺癌影像组学数据库(n=1474)，分别为复旦大学附属肿瘤医院(FUSCC)队列(队列1，n=711)、美国杜克大学(DUKE)队列(队列2，n=641)和美国癌症基因组图谱TCGA队列(队列3，n=122)。对于每个队列，从四个ROIs中提取了前对比和后对比阶段的一阶和纹理特征。
队列1从多组学研究队列中收集了468例患者的数据，包括全外显子测序(n=365)、转录组测序(n=369)、拷贝数变异(n=404)、代谢组学(n=221)、HE染色的病理图像(n=324)，以及随访数据(n=468)，用于识别IITH及其预后意义;验证IITH、GITH和细胞形态ITH(MITH)之间的相关性;并确定IITH的生物学特征。队列2包括临床特征和随访数据(n=618)，用于验证IITH标志的预后价值。队列3中有匹配的转录组数据(n=121)，用于验证IITH表型的生物学特征。
图2. 多中心乳腺癌患者队列
(A：数据库纳排流程图;B：三个队列中多维数据的样本大小;C：本研究中三个队列的作用)
识别IITH
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根据所有提取的影像学特征的计算公式和明确定义[8]，确定42个与异质性相关的一阶和纹理影像学特征，用于评估不同样本的IITH。考虑到四个ROIs以及提取特征的不同增强阶段，最初有1968个特征包含在此分析中。计算的中位绝对偏差(MAD)以评估样本间影像学特征的差异，MAD>1的特征被视为高度可变。在发现队列(FUSCC队列)中，选择了203个高度可变与异质性相关的特征，其中包括40个一阶特征和163个纹理特征。一阶特征和纹理特征分别用于相似性网络融合(SNF)以生成两种不同的表型(图3A)。同样的标准和流程被应用于验证队列，以确定DUKE和TCGA队列中具有高和低IITH的患者。
高IITH患者有更高的T分期(队列1，P=0.075;队列2，P<0.001;队列3，P=0.032)和N分期(队列2，P=0.004;队列3，P=0.035)，并且雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)阳性的比例更低(队列1和队列2的P≤0.001)。高IITH肿瘤更大，形状更不规则，具有更高的总体灌注，表现为“进入”模式。将异质性指数(HI)定义为：与肿瘤异质性正相关的z分数标准化值和与肿瘤异质性负相关特征的相反值的和。计算了每个样本的HI分数。相应地，更大的HI表示更大的成像异质性(图3B、C和D)。
图3. 肿瘤内影像组学、临床病理特征以及无复发生存和总生存结果
典型DCE-MRI图像表明，具有高IITH的肿瘤图像呈现出高度异质的增强模式，而低IITH的样本则更加均匀(图3E、F)。总之，本研究在大型多中心乳腺癌影像学队列中开发了一种影像学特征标志，用于识别不同的IITH状态。
IITH预后价值的发现和验证
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在对发现队列进行长时间随访后验证了IITH的预后价值。具有高IITH的患者表现出明显更差的无复发生存期(RFS)(P=0.004，图3G)。多变量Cox分析显示，在排除已知预后因素(肿瘤大小、淋巴结阳性、淋巴血管浸润状态和临床亚型)后，高IITH是预后不良的独立预测指标(HR=2.15，95%CI 1.22-3.80，P=0.008;图3H和图4)。同时，IITH也是OS的预测因素(P=0.004;图3I和图4)。
本研究在DUKE队列中进行了外部验证。如前所述，在DUKE队列中确定了高IITH和低IITH的患者，并发现高IITH患者的RFS较低IITH的患者更差(P=0.003;图3J)。多变量Cox分析也验证了IITH在DUKE队列中的独立预后价值(HR=1.79，95%CI 1.01-3.18，P=0.046)。总之，本研究揭示了IITH亚型的独立预后预测能力。
图4. FUSCC队列的多变量Cox分析显示，高IITH是预后不良的独立预测指标
IITH与基因组和病理性ITH的相关性
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本研究比较了IITH与基因组学ITH(GITH)和细胞形态学ITH(MITH)以确定IITH的可靠性。GITH通过采用突变等位基因肿瘤异质性(MATH)算法来测量[9](图5A)，MATH值增加表示表示肿瘤内部的基因组异质性(GITH)逐渐增加。与低IITH患者相比，高IITH的患者在基因组上更具有遗传多样性或基因组异质性(P=0.049;图5B)。另外，本研究还计算了肿瘤突变负荷(TMB)和新生抗原负荷，发现高TMB(P=0.005)和新生抗原负荷(P=0.043)发生于高IITH患者中(图5C、D)。
图5. 肿瘤内影像组学、基因组学与细胞形态学异质性的相关性
本研究从HE染色的肿瘤标本中提取了表征肿瘤、基质和炎症细胞核的14个形态特征和4个纹理特征，通过量化每个肿瘤样本内核形态的变异来评估MITH。值得注意的是，高IITH的肿瘤在CurvMean(P=0.009)、CurvStd(P=0.020)和IntensityMax(P=0.036)等特征中显示出较高的MITH(图5E、F和G)。此外，还观察到基质和炎症核中的MITH升高。典型病理图像展示了细胞形态学ITH，如图5H和I所示。总之，通过DCE-MRI技术获得的IITH与基因组学ITH和细胞形态学ITH评估结果一致。
与IITH相关的基因组、转录组和代谢组的改变
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本研究通过多组学分析评估高IITH和低IITH肿瘤之间的生物学差异。但并未观察到高IITH和低IITH肿瘤在高频率体细胞突变或拷贝数变异方面存在显著差异。尽管具有更高的染色体不稳定性(通过高TMB和新生抗原负荷表示)，但高IITH肿瘤中没有引发有效的抗肿瘤免疫反应。使用基因集富集分析(GSEA)评估高IITH肿瘤中富集的信号通路，结果显示，高IITH肿瘤中上调的信号通路包括Hippo[标准化富集分数(NES)=1.86，P=0.004]、RAS(NES=1.69，P=0.02)、PI3K-AKT-mTOR(NES=1.53，P=0.04)和MAPK(NES=1.50，P=0.05)等多个与致癌或癌症特征相关的信号通路。
同时，高-IITH样本中还富集了癌细胞的典型恶性行为，如细胞增殖、细胞粘附(NES=1.60，P=0.027)、蛋白质处理(NES=1.92，P=0.002)、干细胞(NES=1.64，P=0.018)、缺氧(NES=1.68，P=0.045)和血管生成(NES=1.59，P=0.053)。此外，高IITH肿瘤的代谢也表现出广泛失调，包括脂肪酸、氨基酸、有机酸、核苷酸和糖原的上调(图6A)。
图6. 肿瘤内影像组学异质性高的乳腺癌生物学特征
根据NES对所有富集的信号通路进行排名，以确定高IITH肿瘤组和低IITH肿瘤组在哪些生物过程最为显著或富集。在高IITH肿瘤中，铁死亡(NES=2.27，P<0.001)、核因子红细胞2相关因子2(NRF2)(NES=2.08，P<0.001)、活性氧自由基(ROS)(NES=2.00，P<0.001)和胆汁酸代谢(NES=2.08，P<0.001)是最为上调的信号通路，而与DNA双链断裂相关的过程(NES=-1.71，P=0.024)在低IITH肿瘤中最为活跃(图6B)。这些结果揭示了这两个患者亚组的不同生物学特点，其中高IITH肿瘤在代谢方面非常活跃，并面临氧化应激，而低IITH肿瘤中更常见的是DNA损伤修复。
基于转录组分析中发现的富集代谢通路，使用差异丰度(DA)分数分析来比较高IITH组和低IITH组的代谢组学差异。在具有三个或更多已注释代谢产物的代谢通路中识别了14个上调通路。在这些上调通路中，有三个DA分数至少为0.25(图6C)。在高IITH肿瘤中，特别是脂肪酸的生物合成和延伸这两个代谢通路表现出增强的活性(图6C)。总而言之，通过转录组和代谢组分析，本研究表明，肿瘤内影像组学异质性高的肿瘤是一种具有明显恶性特征和代谢紊乱的癌症表型，导致肿瘤细胞具有更明显的铁死亡倾向。
铁死亡是高IITH肿瘤的生物学特征和潜在治疗靶点
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本研究对在转录组分析中鉴定出的最重要的分子过程进行了深入探索，结果显示，在高IITH肿瘤中，铁死亡的富集程度排名第一[NES=2.27，P<0.001，错误发现率(FDR)=0.024;图7A]。因此，在发现组和TCGA验证组中使用单样本基因集富集分析生成了一个铁死亡通路得分，确认铁死亡在高IITH肿瘤中显著上调(图7B和C)。并且，与铁死亡相关的关键因素包括ROS、铁代谢和脂质合成，在高IITH肿瘤中大量存在(图6A)。
图7. 肿瘤内影像组学异质性高的乳腺癌对铁死亡靶向治疗敏感
本研究进行了综合多组学分析以验证高IITH肿瘤中铁死亡通路明显上调的假设。首先，比较了高IITH和低IITH样本的脂质和氧化脂质丰度。综合代谢组学和脂质组学分析显示，触发铁死亡所必需的脂肪酸、磷脂酰乙醇胺和氧化脂质的水平在高IITH样本中显著升高(图7D)。此外，与触发铁死亡关键生物过程相关的表达谱也在高IITH样本中上调，包括铁的摄取(P=0.018)和利用(P=0.017)、不饱和脂肪酸生物合成(P=0.078)以及ROS途径(P=0.008)(图7E)。与此同时，抑制铁死亡的途径，如硫代还原酶过程也有所增加(P=0.010)。这些发现意味着，尽管在高影像异质性肿瘤中铁死亡的启动明显，但癌细胞同时采用了补偿性机制来阻止程序性细胞死亡，作为一种自我保护策略。因此，通过阻碍这些抑制性过程如硫代还原酶途径，可以诱导高IITH肿瘤发生铁死亡。
本研究概述了铁死亡的基本生物途径，并对比了高IITH和低IITH肿瘤相对于正常组织的代谢基因表达的差异。如图7F所示，高IITH肿瘤显示出不饱和脂肪酸合成、铁运输、费顿反应和硫代还原酶途径的激活。对与肿瘤铁死亡相关的放射组学特征进行深入探索发现，灰度共生矩阵特征的差异熵和一阶特征的方差表现出显著的图像异质性。总之，通过综合分析发现了铁死亡活性与IITH之间的联系，并提出了这些预后不佳患者的潜在治疗靶点。
讨论与思考
ITH是治疗耐药和临床预后不佳的关键因素。本研究建立了一种无创DCE-MRI放射组学方法评估ITH，称之为IITH。基于PyRadiomic特征的明确定义确定了与肿瘤异质性相关的放射组学特征，在筛选出整套与异质性相关的特征之后，选择在不同样本之间具有显著差异的特征，将样本分成高异质性和低异质性两个组[10]。研究结果表明，高IITH的患者无论是在RFS还是OS方面，均表现出明显较差的临床预后。与先前的研究结果一致以及在DUKE DCE-MRI数据集的外部验证支持了IITH在反映肿瘤预后方面的实用性[11,12]。
为了证明IITH的普适性并扩大其应用范围，本研究还进行了多层次的IITH验证，并建立了IITH、GITH和MITH之间的关联[7,9]。综合分析表明，高IITH样本也表现出更高的基因组异质性、形态异质性、高肿瘤突变负荷和新生抗原负荷，这表明在影像上呈现异质性的肿瘤表现出基因组不稳定性，产生更多的体细胞突变和突变导致的肿瘤抗原。
对高IITH肿瘤的特征进行观察和分析发现，高IITH肿瘤体积较大而形态畸形，对比剂的灌注量也较高。这些特点可能表明这些恶性肿瘤具有更复杂的血管结构，因此在早期对比剂的灌注方面表现出更高的整体水平。放射基因组分析揭示了在高IITH肿瘤样本中存在一些分子途径，与肿瘤生长活跃相关，而低IITH样本中没有这些途径富集，包括细胞增殖、细胞黏附、蛋白质处理、干细胞、缺氧和血管生成。这些典型肿瘤标志性途径均在高IITH肿瘤中上调，包括RAS、MAPK、PI3K-AKT-mTOR和Hippo。合理推测，具有更多异质性增强模式的肿瘤表现出比同质性肿瘤更为恶性的生物学行为，因此导致了更差的预后[13-15]。更高的T和N分期也证实了其恶性特性。此外，转录组学和代谢组学分析显示，高IITH肿瘤表现出代谢激活，特别是脂质和氨基酸代谢，可能是因为这些活跃的肿瘤促进能量代谢过程以满足其对营养的需求[12]。
有趣的是，通过综合多组学分析，本研究发现在高IITH肿瘤中存在显著活跃的铁死亡，前面提到高IITH患者存在高肿瘤突变负荷和新生抗原负荷，ROS途径也富集，从而推测ROS是内部诱发致癌基因激活、产生高TMB并促进ITH的内源诱变剂[16]。既往研究已经阐明了针对肿瘤中铁死亡的治疗价值[17]，主要方案包括促进铁死亡和负调控其抑制途径[18]。本研究发现发现硫氧还蛋白途径可能是高IITH肿瘤逃脱铁死亡的关键机制，针对硫氧还蛋白的铁死亡诱导剂(如ferroptocide)有望成为治疗高IITH乳腺癌预后不佳患者的治疗方案[19]。
总之，通过多组学匹配的大型影像组学数据库，本研究全面解析乳腺癌患者肿瘤内影像组学异质性特征、多维度论证IITH能够可靠地分析肿瘤内异质性，并深入揭示其生物学行为特征，为临床实践提供了肿瘤异质性的无创评估新方法，并为个体化精准靶向治疗策略探索提供了新思路。
参考文献：略
来源：Su, Guan-Hua et al. Radiogenomic-based multiomic analysis reveals imaging intratumor heterogeneity phenotypes and therapeutic targets. Science advances. 2023 Oct 6;9(40):eadf0837.
