21-羟化酶缺陷症（21-OHD）严重危害患儿健康，建立21-OHD的无创产前诊断方法，可为生育指导和临床早期干预提供依据，是临床亟待解决的难题。我们前期应用单体型关联分析的原理，在获得双亲单体型基础上，结合孕妇血浆DNA大规模并行测序数据，基于隐马尔科夫数学模型建立了胎儿单体型解析新方法，成功对1例21-OHD高风险胎儿进行了无创产前诊断。本研究拟进一步针对致病基因CYP21A2 所在目标区域设计探针，采用靶向捕获测序技术对孕妇血浆DNA进行目标区域深度测序，结合基于双亲单体型的生物信息学分析，推断胎儿遗传的亲本单体型，建立针对目标区域的单体型解析新方法。通过优化系统参数提高检测灵敏度和特异性，并降低检测成本，探讨目标单体型解析新方法的可行性，论证该方法在21-OHD无创产前诊断中的应用价值，为该新方法的临床应用提供科学依据，并为其它单基因遗传病的无创产前诊断研究提供借鉴。

21-Hydroxylase deficiency (21-OHD) can be life-threatening if not treated promptly. The noninvasive method for the prenatal diagnosis of 21-OHD is required to improve the guidance for eugenics and the early medical management. Until now, the accurate noninvasive prenatal diagnosis of 21-OHD is still an unresolved issue in clinical practice. With the assistance of the parental haplotypes, we recovered fetal haplotypes using a hidden Markov model (HMM) through maternal plasma DNA sequencing. Using the haplotype resolving method, we have successfully inferred the haplotypes and genotype of a fetus at risk of classic 21-OHD. In this study, capture probes will be designed for enriching the sequences in targeted genomic region of the CYP21A2 gene, and targeted massively parallel sequencing will be performed to get higher sequencing depth and coverage. This study aims to optimize the system settings, improve detection sensitivity and specificity, and reduce the testing cost. We will examine the feasibility of the targeted haplotype resolving method for noninvasive prenatal diagnosis of 21-OHD in clinic. The study will establish a new method for noninvasive prenatal diagnosis of 21-OHD, and provide a paradigm for noninvasive prenatal diagnosis of other single-gene disorders.

21-羟化酶缺陷症（21-OHD）严重危害患儿健康，建立21-OHD的无创产前诊断方法，可为生育指导和临床早期干预提供依据。单基因疾病（如21-OHD）无创性产前诊断仍然面临技术挑战，主要限制在于孕妇血浆DNA中胎儿DNA含量稀少，以及大量母体DNA背景干扰。本项目基于孕妇血浆DNA靶向捕获测序建立了21-OHD无创产前诊断新方法，并评价其临床应用价值。 首先建立了目标区域靶序列捕获测序方法，可实现1607个高度杂合位点序列的捕获测序，捕获大小为274.15kb，分布在CYP21A2基因上下游1 Mb基因组区域，另外包括Y染色体特异性区域，捕获大小为13kb，用于胎儿性别鉴定，可实现对外周血DNA和孕妇血浆DNA的高深度测序。以先证者及其双亲组成三元核心家系，对各成员基因组DNA进行靶向捕获测序，基于三元核心家系基因型数据构建双亲单体型。在获得双亲单体型基础上，采用靶向捕获高通量测序对孕妇血浆DNA进行CYP21A2基因上下游目标区域深度测序，获得有效SNP位点处的碱基分布信息，应用构建的隐马尔科夫模型计算孕妇血浆DNA中胎儿父源和母源单体型的累积概率，推断胎儿遗传的亲本单体型。将孕妇基因组DNA与胎儿基因组DNA按不同比例混合制备成一系列胎儿DNA浓度不同的混合DNA，模拟不同胎儿DNA浓度的孕妇血浆样品，研究了胎儿DNA浓度和测序深度对无创产前检测准确性的影响，进一步完成了12个家庭14个血浆DNA样品的无创产前基因检测。确定胎儿DNA浓度的最低检测限为2％，血浆DNA样品的最低测序深度为38×，可满足准确推断胎儿单体型的要求。无创产前基因检测结果表明孕妇血浆DNA中胎儿DNA浓度范围为5.5%到15.54%之间，平均测序深度范围为91.31×到339.95×之间。所有14个血浆DNA样品的胎儿单体型推断结果准确，最早检测孕周为8周加1天。建立的21-OHD无创产前诊断方法准确性、可靠，对胎儿DNA浓度和测序深度的要求低，说明该方法可在早孕期期实施无创检测，且成本较低，具备临床应用价值。