华支睾吸虫感染可引起胆管上皮增生及肝纤维化，但其引起肝纤维化发生的确切机制仍不清楚。活化的肝星状细胞(HSCs)是肝纤维化时产生细胞外基质的主要细胞。申请者等之前研究显示华支睾吸虫分泌型磷脂酶A2 (CssPLA2)可通过直接与HSCs细胞结合而促进其增殖活化，但目前对与其结合的HSCs受体蛋白及增殖活化机制仍不明确。为此，拟以CssPLA2为诱饵，通过酵母双杂交筛选人肝cDNA文库及免疫共沉淀结合质谱鉴定HSCs细胞膜上与其相作用的受体蛋白，并对其互作作用进行验证；CssPLA2在体内外是通过何种机制而引起HSCs活化亦是本项目重点阐明的内容；此外还通过体内外实验对受体蛋白在CssPLA2致HSCs增殖活化及肝纤维化过程中的作用进行验证。本项目的开展将有助于揭示CssPLA2激活HSCs的机制，并阐明其在华支睾吸虫感染致肝纤维化过程中的作用，从而为抗肝吸虫性肝纤维化药物治疗提供新的靶标。

Infection of Clonorchis sinensis (Cs) can cause hyperplasia of biliary epithelial cells and development of hepatic fibrosis. However, the intrinsic molecular mechanism of activation of hepatic stellate cells (HSCs) which caused by Clonorchis sinensis infection is still unclear. Activated hepatic stellate cells are the main cells producing extracellular matrix (ECM) in liver fibrosis. Our previous studies have shown that Clonorchis sinensis secreted phospholipase A2 (CssPLA2) can directly interact with the cell membrane protein(s) of hepatic stellate cells in vitro, causing cells activation and proliferation. However, the receptor(s) on HSCs cells and its role in HSCs activation are still unknown. Therefore, in this study CssPLA2 will be used as a “bait” to identify its interaction protein(s) by screening human liver cDNA library using yeast two-hybrid system. Co-immunoprecipitation combined with mass spectrometry will also be used for its receptor(s) identification. The signaling pathway that is involved in HSCs activation caused by CssPLA2 will also be resolved in this study. We will also test the role of CssPLA2's receptor in HSCs activation process. To answer those questions will help us further understand the molecular mechanism of HSCs activation in Clonorchis sinensis infection. In addition, it may provide a novel drug target for the treatment of liver fibrosis caused by Clonorchis sinensis.

研究背景：近年来，华支睾吸虫病发病呈现上升趋势，目前已成为我国流行最广、危害最大的食源性寄生虫病。国内外学者的大量研究包括流行病学调查、临床病例分析以及动物实验等均证实华支睾吸虫感染可导致肝纤维化及肝硬化的发生。虽然目前对肝纤维化发生的一般机制有一定的认识，但对华支睾吸虫感染所致肝纤维化的具体机制尚不完全清楚。为此，我们拟通过酵母双杂交文库筛选及免疫共沉淀结合质谱分析，鉴定肝星状细胞上与CssPLA2作用的受体蛋白分子，明确CssPLA2活化HSCs的机制，以及受体蛋白在此过程中的作用。研究内容：本项目拟通过酵母双杂交文库筛选及免疫共沉淀结合质谱分析的方法来获得肝星状细胞上与CssPLA2相作用的受体蛋白。酵母双杂交是经典的蛋白互作方法，系统能够比较全面的发现与目标蛋白相互作用的未知蛋白，适合发现相互作用尚不明确的蛋白质的研究。研究显示可促进肝星状细胞活化的诱导因子众多，常见的诱导因子有TGF-β1、PDGF、CTGF、IGF-1、VEGF、TNF-α等，这些细胞因子通过不同的细胞内信号通路而激活肝星状细胞。CssPLA2是通过何种途径激活肝星状细胞以及受体蛋白在CssPLA2激活肝星状细胞及纤维化过程中的作用是本研究的重点。研究结果：通过酵母双杂交及免疫共沉淀结合质谱分析等鉴定出肝星状细胞膜上与CssPLA2相作用的受体蛋白分子 TM7SF3。细胞内信号通路如TGF-β1/smad通路、ERK通路、JNK 通路、NF-κB 通路均可激活肝星状细胞，其中JNK 信号通路激活肝星状细胞作用较为显著。受体蛋白分子 TM7SF3 在肝星状细胞活化过程中发挥了重要作用。抗体封闭受体蛋白分子后，CssPLA2激活肝星状细胞作用明显减弱。研究意义：本研究将有助于揭示CssPLA2激活HSCs的机制，并明确其在肝吸虫感染致肝纤维化过程中的作用，通过干扰CssPLA2活化HSCs的途径，有可能为抗肝吸虫性肝纤维化的治疗带来新的希望。