抗肿瘤活性多肽是一类新型的抗肿瘤药物，具有分子量小、低毒性、高活性、高度选择性等特点，对于肿瘤的临床治疗具有重要价值。蟾蜍毒素是提取抗肿瘤多肽的重要来源，由于蟾蜍毒素所含蛋白的丰富性和多肽结构影响其抗肿瘤活性的复杂性，对于蟾蜍毒素活性多肽的提取，及其药理活性和抗肿瘤分子机制，仍有待深入研究。本申请项目以东方铃蟾皮肤分泌毒素为研究对象，在前期工作中，通过凝胶过滤层析和高效液相分离的方法，得到四组抗肿瘤多肽成分，并利用体外实验，初步验证了铃蟾多肽具有抑制肝癌细胞增殖的药理活性。在这个基础上，拟对提取物进一步分离纯化以得到多肽单体；运用串联质谱，结合分子克隆技术，对抗肿瘤多肽的结构进行表征；通过细胞模型和动物模型，验证铃蟾多肽的抗肿瘤药效及生物安全性，同时，对多肽活性物质潜在的多种抗肿瘤机制进行初步探索，为以铃蟾多肽为先导化合物，进一步开发新型抗肿瘤药物提供一定的数据支持。

Small-molecular weight antitumor peptides are a new type of antitumor drugs with small molecular weight, low toxicity, high activity and high selectivity. They have been already proven to be of significant valuable in cancer therapy. Animal toxins are one of the major sources of antitumor peptides, as Bufotoxin contains abundant of proteins and the secondary structures of peptides lead to its complex anticancer mechanism, so it is worth further studying the isolation, pharmacological activities and anticancer mechanism of peptides from bufotoxin. In this project, we focus on the toxin of Oriental fire-bellied toad (Bombina orientalis) as our research material. In the previous study, four antitumor peptide components were isolated through gel filtration and HPLC separation and their antitumor activities were identified by anticancer screening assay. Based on the earlier investigation, we plan to further purify and identify the antitumor peptides from the HPLC fragments, to characterize the structure of peptides by combining the tandem mass spectrum and molecular cloning technologies. We will investigate the anti-proliferation effect of these peptides on liver tumor cell lines in vitro and vivo model to evaluate the efficacy and safety of anticancer peptides and also explore the underlying multiple mechanisms of bioactive peptides, which will provide some bases for using the anticancer peptides from B. orientalis as a lead compound in the small-molecular weight antitumor peptide drug development.

抗肿瘤活性多肽是一类新型的抗癌药物，以相对分子量小、低毒性、高活性、易于穿透肿瘤细胞膜等特点，受到医药研究者的广泛关注。蟾蜍毒素作为一种重要的抗肿瘤多肽类物质的天然提取源，已经为人们所广泛研究。然而，鉴于蟾蜍毒素所含蛋白的丰富性，和不同多肽结构影响其抗肿瘤活性的复杂性这两方面因素，对蟾蜍毒素中所富含的抗肿瘤多肽物质的分离提取及其药理活性和抗肿瘤构效关系的研究，依然有待于进一步深化。本项目以东方铃蟾皮肤分泌毒素为研究对象，对东方铃蟾皮肤分泌多肽进行分离鉴定和结构表征，通过细胞模型和动物模型，验证铃蟾多肽的抗肿瘤药效及生物安全性，同时，对多肽活性物质潜在的多种抗肿瘤机制进行初步探索，以期为将来深入探讨其最为有效的抗肿瘤作用机理，提供一些方向的选择。首先，运用生化分离技术，结合分子克隆方法，从东方铃蟾皮肤分泌毒素中分离鉴定出4种具有抗肿瘤活性的bombinin家族多肽，其中3种为首次发现的多肽，对多肽的一级、二级结构及前体基因序列进行表征，通过蛋白质分析网络服务器预测多肽的理化性质和空间构型。然后采用固相合成法人工合成四种多肽，针对合成的多肽单体，通过体外细胞实验和移植瘤小鼠活体实验，评价其抗肿瘤活性和对机体可能的毒副作用。四种多肽在体外均能显著抑制人体三种肝癌细胞的生长增殖，铃蟾多肽在Hepa1-6荷瘤小鼠和SK-HEP-1移植瘤裸鼠模型中表现出较好的抗肿瘤活性。最后，以抗癌活性较强的多肽Bombinin-BO1为探针化合物，对铃蟾多肽可能的多种抗肿瘤作用途径进行初步探索。经研究发现，铃蟾多肽Bombinin-BO1能够破坏肝癌细胞膜质结构，诱导肝癌细胞发生坏死；同时，Bombinin-BO1可诱导肝癌细胞发生晚期凋亡，其诱导凋亡的作用是通过增加凋亡相关蛋白Bcl-2的表达水平，增强细胞内线粒体膜的通透性，引起半胱氨酸蛋白酶caspase-3的活化，从而诱发了线粒体途径的凋亡过程。另外，Bombinin-BO1还具有抑制血管生成的作用。以上研究成果，为以铃蟾多肽作为先导化合物，进一步开发新型抗肿瘤药物奠定理论基础和物质基础。