慢性乙型肝炎（慢乙肝）严重危害人民健康。中医药在乙肝治疗中发挥着重要作用。中医证候客观化、标准化研究是对中医药临床疗效进行客观、科学评价的前提和基础。我们在依托于国家十二五科技重大专项（2012ZX10005001-004）研究中借助微阵列芯片和实时定量PCR方法进行检测，发现在慢乙肝肝胆湿热证和肝肾阴虚证患者血清中microRNAs存在差异表达；与肝肾阴虚证患者和健康者比较，在肝胆湿热证患者血清中miR-583和miR-663呈高表达(P<0.001)；ROC曲线分析显示，miR-583和miR-663能将肝胆湿热证和肝肾阴虚证明显区分开。本项目在前期研究基础上，运用分子/细胞生物学及生物信息学等技术手段开展miR-583和miR-663功能研究，揭示miR-583和miR-663分子调控机制。其研究对于阐释慢乙肝证候的形成机制、揭示不同中医治法作用原理等，具有重要的学术意义和应用前景。

Hepatitis B virus (HBV) infection is one of the major health problems in China. Traditional Chinese medicine (TCM) ZHENG as the key pathological principle is to understand the human homeostasis and guide TCM treatment. Our previous study was supported by National Science and Technology Major Project of China, No. 2012ZX10005001-004. We found that serum miRNAs were differentially expressed between Liver-gallbladder dampness-heat syndrome (LGDHS) and Liver-kidney yin deficiency syndrome (LKYDS). Circulating miR-583 and miR-663 were significantly higher (P<0.001) in CHB patients with LGDHS than those with LKYDS and healthy controls (Ctrls). ROC curve analysis revealed that miR-583 and miR-663 were sensitive and specific enough to distinguish LGDHS from LKYDS. MiR-583 and miR-663 may be potential markers for ZHENG differentiation in CHB. Further study will investigate the function of miR-583 and miR-663. It might help to elucidate the biological role in the progression of chronic liver diseases with TCM ZHENG.

本项目研究发现，慢乙肝证候差异表达的2个miRNAs（miR-583和miR-663a），其中miR-663a与肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）和肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）细胞增殖密切相关，所以本课题重点研究内容主要集中在：“miR-663a在肝星状细胞和肝癌细胞的作用及相关机制研究”。本项目运用分子/细胞生物学及生物信息学等技术手段开展miR-663a功能研究，揭示miR-663a分子调控机制。体外实验研究发现，miR-663a能抑制HSCs的增殖和迁移，miR-663a能靶向多个基因和信号通路（如TGF-β/SMAD信号通路）影响HSCs活化相关蛋白的表达，并调控相关LncRNAs的表达，推测LncRNA/miR-663a/TGF-β/SMAD信号通路在HSC活化过程中起到重要的作用。生物信息学分析显示，miR-663a在肝癌（HCC）中（HCC，n=147；正常肝组织，n=50）呈低表达（P=0.0164），miR-663a启动子在HCC中（HCC，n=204；正常肝组织，n=65）存在异常高甲基化状态（P=6.25×10-14）。体外实验发现，miR-663a在HCC细胞中也呈低表达，miR-663a过表达能抑制HCC细胞的增殖和迁移，HCC细胞中miR-663a靶向多个靶基因和信号通路，并调控相关LncRNAs的表达。除此之外，在本基金的资助下，还进行了其他miRNAs的相关研究。因此，本项目揭示了miR-663a在肝星状细胞和肝癌细胞的作用和部分调控机制，对于阐释慢性肝病（肝纤维化和肝癌）的进展机制、抗纤维化和抗肿瘤药物的靶点研究提供了新的思路和方法，具有重要学术意义。鉴于miR-663a的作用，推测慢乙肝病证患者循环中miR-663a的高表达，属于机体的保护性防御反应。