结核病是世界三大传染病之一，由结核杆菌（Mtb）引起。Mtb为胞内寄生菌，其侵袭机制尚不十分清楚。已有研究表明，许多胞内寄生菌借助细胞骨架重排而侵入宿主细胞，此过程主要由Rho家族的Rac、Rho及CDC42蛋白调控。本项目采用RNA干扰技术，旨在探讨Mtb侵袭与细胞骨架重排的关系，确定Rac、Rho及CDC42蛋白在该过程中的作用。本研究首先合成针对Rac、Rho和CDC42基因的siRNA分子，同时构建上述基因与EGFP的融合表达载体，再将两者共转染细胞后筛选出高效抑制活性的siRNA分子；接着，构建高效抑制上述基因表达的siRNA真核表达质粒，再将其转染人肺上皮细胞，随即以Mtb侵染细胞，电镜法检查细胞骨架重排情况，从而确定Rho家族成员在Mtb引起的细胞骨架重排中的作用，并分析其信号转导机制。本研究有望为阐明结核杆菌侵袭细胞机制提供新的理论依据，同时为结核病防治提供新策略。

采用293T细胞基因过表达技术，筛选构建了抑制RhoA、Rac1、和Cdc42基因表达的siRNA真核质粒（pGCsi-RhoA、pGCsi-Rac1、pGCsi-Cdc42），其对A549细胞相应RhoA、Rac1、和Cdc42基因的表达抑制率分别为（84.7±2.6）%,(86.6±3.7)%和(81.4±3.2)%。以结核杆菌（Mtb）16S rDNA基因为靶基因，建立优化了Mtb荧光定量PCR检测方法，灵敏度为1.2 pg/μL基因组DNA，批内和批间变异系数为0.27%和1.26%。采用干扰-侵袭实验观察了Rho家族蛋白在Mtb侵袭细胞中的作用，结果表明：抑制RhoA基因表达导致细胞微丝重排以及内吞Mtb能力下降；抑制细胞Rac1基因表达致使细胞黏附Mtb能力、微丝重排能力以及内吞Mtb能力均显著下降；抑制Cdc42基因表达后，细胞黏附Mtb能力、微丝重排能力以及内吞Mtb能力未发生改变。本项目认为：Mtb在侵袭A549细胞时，"拉链"和"触发"机制同时存在，RhoA基因参与"拉链"机制，Rac1基因同时参与"拉链"和"触发"机制，Cdc42基因在Mtb侵袭中的作用尚不确定。