中文摘要
通过简并引物设计和DNA Walking技术从四种不同侵染类型的食线虫真菌中克隆得到侵染性丝氨酸蛋白酶编码基因，其中粉红螺旋聚孢霉和淡紫拟青霉的蛋白酶和刀孢轮枝菌的丝氨酸蛋白酶编码基因Ver112具有较高的同源性。为了深入研究这些侵染性蛋白酶的结构和催化机理，对蛋白酶Ver112和PL646的晶体结构进行了解析和比较，对它们的催化机制进行了深入探讨。并通过异源表达成功构建了Ver112多拷贝过表达工程菌。此外，通过Genome Walking的方法，从刀孢轮枝菌、厚垣普可尼亚菌、粉红螺旋聚孢霉和淡紫拟青霉中分别克隆得到几丁质酶的编码基因，并通过异源表达对几丁质酶的功能进行了鉴定。为进一步研究几丁质酶结构和功能的关系，首次对几丁质酶和抑制剂复合物的晶体结构进行了解析。本研究首次报到了食线虫真菌侵染性蛋白酶和几丁质酶的晶体结构。项目执行期间，获得云南省科学技术奖一等奖1项，发表研究论文16篇，其中SCI论文15篇，申请专利3项，有1项已经获得授权，参加3次国际会议并做会议报告，培养毕业6名硕士研究生。本研究超额完成了项目预期的研究内容和目标。
英文摘要
Pathogenicity associated serine proteases were cloned from different nematophagous fungi using degenerate primers and DNA Walking technique. Among them, serine proteases from Clonostachys rosea and Paecilomyces lilacinus shared a high degree of similarity to serine protease Ver112 from Verticillium psalliotae. In order to learn the relationship of structure and catalytic mechanism of these cuticle-degrading proteases, we got the crystals of proteases Ver112 and PL646, resolved the crystal structures using X-ray diffraction, and compared their structures and biochemical characterizations. Meanwhile, The engineering strain was constructed by increasing the copies number and expression level of gene Ver112. Moreover, four genes encoding for chitinase were cloned using genome Walking method from V. psalliotae, C. rosea, P. lilacinus, and Pochonia chlamydosporia, respectively. The functions of these chitinases were identified by expressed them in E. coli or Pichia pastoris, the recombinant chitinases can degrade chitinous components of eggs of the root-knot nematode Meloidogyne incognita. Furtherly, the chitinase Crchil was crystallized and resolved by X-ray diffraction.The crystal structures of serine protease and chitinase were reported in this project for the first time. During this study, one item of major award
结题摘要
通过简并引物设计和DNA Walking技术从四种不同侵染类型的食线虫真菌中克隆得到侵染性丝氨酸蛋白酶编码基因，其中粉红螺旋聚孢霉和淡紫拟青霉的蛋白酶和刀孢轮枝菌的丝氨酸蛋白酶编码基因Ver112具有较高的同源性。为了深入研究这些侵染性蛋白酶的结构和催化机理，对蛋白酶Ver112和PL646的晶体结构进行了解析和比较，对它们的催化机制进行了深入探讨。并通过异源表达成功构建了Ver112多拷贝过表达工程菌。此外，通过Genome Walking的方法，从刀孢轮枝菌、厚垣普可尼亚菌、粉红螺旋聚孢霉和淡紫拟青霉中分别克隆得到几丁质酶的编码基因，并通过异源表达对几丁质酶的功能进行了鉴定。为进一步研究几丁质酶结构和功能的关系，首次对几丁质酶和抑制剂复合物的晶体结构进行了解析。本研究首次报到了食线虫真菌侵染性蛋白酶和几丁质酶的晶体结构。项目执行期间，获得云南省科学技术奖一等奖1项，发表研究论文16篇，其中SCI论文15篇，申请专利3项，有1项已经获得授权，参加3次国际会议并做会议报告，培养毕业6名硕士研究生。本研究超额完成了项目预期的研究内容和目标。