中文摘要
以申请者在中外猪种背最长肌mRNA差异显示中获得的两个新EST为基础,克隆其相应基因- -CXCL10和ARF4基因的全长cDNA序列,利用生物信息学方法预测其编码蛋白质的结构、功能,并且对这两个基因进行了性状关联分析,初步推断出这两个基因与猪骨骼肌生长发育相关。本项目在这些前期研究工作的基础上,深入研究这两个基因在猪骨骼肌生长发育过程中的生物学功能,即在离体培养的猪骨骼肌卫星细胞中进行这两个基因表达的RNAi实验,分析这两个基因在猪骨骼肌卫星细胞增殖、迁移和分化过程中所起的作用,初步揭示CXCL10和ARF4基因在猪骨骼肌生长发育中的功能。本研究对于猪骨骼肌生长发育相关功能新基因的发掘以及我国积极参与国际上猪基因产权的争夺有具有重要意义,同时本研究也是对其它猪骨骼肌生长发育相关基因功能研究模型的一种探索,因此本项目具有重要的学术和应用价值。
结题摘要
根据本人注册的猪CXCL10与ARF4基因的编码区序列完成CXCL10与ARF4基因各10个RNAi靶位点序列的选择、shRNA的设计和制备,然后在猪骨骼肌卫星细胞中进行CXCL10和ARF4基因表达的短暂RNAi,通过RT-PCR,Real time PCR和WESTERN BLOT检测短期RNAi的基因抑制效果,筛选出对猪CXCL10与ARF4基因表达具有显著抑制作用的shRNA表达载体各两个,对具有显著抑制效率的shRNA表达载体进行腺病毒蛋白包装,收获病毒, 感染猪骨骼肌卫星细胞,进行长期RNAi,检测CXCL10和ARF4基因沉默的效应,发现猪CXCL10和ARF4基因在RNAi 后骨骼肌卫星细胞数目比对照组显著减少,骨骼肌卫星细胞的迁移距离比对照组显著变小,骨骼肌卫星细胞分化指示基因MyoD和Myf-5的表达量也出现显著降低,表明猪CXCL10和ARF4基因表达的抑制会导致骨骼肌卫星细胞增殖显著减少(P<0.05),同时导致骨骼肌卫星细胞迁移显著变缓及骨骼肌卫星细胞分化出现显著抑制(P<0.05)。由此推论,猪CXCL10与ARF4基因对猪骨骼肌的生长发育起重要作用。
