中文摘要
PB1-F2是最近发现的A型流感病毒毒力相关的蛋白质,但对其致病作用的分子机制以及在病毒生活周期中的作用还知之甚少。本研究拟采用酵母双杂交技术筛选与流感病毒PB1-F2相互作用的宿主蛋白,并用GST pull-down、免疫共沉淀和激光共聚焦技术进一步验证PB1-F2与靶蛋白在体外和体内的相互作用。利用biacore仪检测蛋白之间是否直接的相互作用以及相互作用的亲和力。一方面,研究筛选到的宿主蛋白对PB1-F2的促细胞凋亡活性的影响,阐明PB1-F2蛋白与宿主蛋白的相互作用对线粒体功能的影响;另一方面,研究PB1-F2对相互作用的宿主蛋白功能的影响,以期发现PB1-F2参与的细胞信号调节通路。本研究旨在阐明PB1-F2致病作用的分子机制,以及其在病毒生活周期中的确切功能,为流感病毒的致病机制研究和流感的防控提供必要的理论依据。
结题摘要
PB1-F2是A型流感病毒毒力相关的重要因子,但对其致病作用的分子机制以及在病毒生活周期中的作用还知之甚少。本研究采用酵母双杂交技术筛选人白细胞文库中与PB1-F2相互作用的宿主蛋白,经过三次的严格筛选以及酵母回转实验验证,最终得到22个与PB1-F2相互作用的蛋白,这些蛋白质主要包括激酶、激酶受体、分子伴侣、驱动蛋白以及信号转导蛋白等。GST pull-down、免疫共沉淀和激光共聚焦技术都进一步证明了PB1-F2与异源三聚体鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β2亚单位(Gβ2)存在相互作用,并且PB1-F2的三个缺失突变体均与Gβ2发生相互作用,表明两者存在多个结合位点。上述三种技术同样验证了巨噬细胞移动抑制因子(MIF)与PB1-F2的相互作用。功能研究发现,PB1-F2可使MIF的mRNA和蛋白水平上调;另一方面,MIF也下调PB1-F2的促凋亡活性,这暗示PB1-F2可能通过MIF发挥其促进继发细菌感染的作用。我们的研究鉴定并发现了几个重要的PB1-F2的功能性相互作用宿主蛋白,为更深入洞悉PB1-F2的分子作用机制和流感病毒的致病机制奠定了良好的基础,也为流感的防控提供了重要线索。
