MicroRNAs (miRNAs)可以通过直接靶向转录因子或代谢途径的关键酶基因参与植物次生代谢的调控，但其在菘蓝活性成分直铁线莲宁B生物合成中的调控作用还不清楚。本研究中，转录组测序和前期的菘蓝基因组信息将用于构建直铁线莲宁B的生物合成途径。然后利用MeJA 处理的菘蓝的毛状根体系，构建miRNA 文库、测序，筛选可能与菘蓝直铁线莲宁B合成相关的miRNAs，并对靶基因进行预测，以此构建miRNAs介导的直铁线莲宁B生物合成的调控网络。进一步通过构建相关miRNAs的过表达和低表达转基因毛状根，通过miRNAs和靶向基因的表达分析以及直铁线莲宁B的含量验证miRNAs介导的直铁线莲宁B生物合成的调控网络。总之，本研究将有助于阐释miRNAs介导的菘蓝直铁线莲宁B生物合成调控机制，并为通过调控miRNAs提高菘蓝中直铁线莲宁B的含量打下基础。

MicroRNAs (miRNAs) are involved in regulating plant secondary metabolism by directly targeting transcription factors, or key enzyme genes of metabolic pathway, but it is not clear whether miRNAs are involed in regulating biosynthesis of active ingredient clemastinin B in Isatis indigarica Fort.. In this study, transcriptome sequencing and genome information will be used to build the biosynthetic pathways of clemastinin B.Then in MeJA –treated hairy root system, miRNAs will be extracted and sequenced. MeJA-regulated miRNAs will be selected and their target genes will be predicted by bioinformatics strategy. Based on miRNAs transcriptome, miRNAs-mediated regulatory network in the biosynthesis of clemasitinin B will be built. In order to validate the function of miRNAs in regulating biosynthetic pathway of clemastinin B, overexpressed and knock-down of miRNAs transgenic lines will be made in hairy root system . Expression analysis of miRNAs and target genes and content of clemastinin B in transgenic hairy root will further confirm their function in regulating the biosynthetic pathway of clemastinin B. Taken together, this study may enhance our understanding how miRNAs mediate the biosynteesis of clemastinin B and play foundation for improve the content of clemastinin B in by controlling miRNAs in Isatis indigarica Fort..

本研究以菘蓝为研究材料，拟通过比较转录组筛选与苯丙素类抗病毒活性成分生物合成相关的miRNAs，并对其调控机制进行探索性研究。研究内容包括两个部分：第一部分是基于菘蓝基本转录组进行苯丙素类代表性活性成分直铁线莲宁B生物合成关键酶的挖掘、功能鉴定；第二部分就是筛选和鉴定与其生物合成相关的miRNAs。在完成第一阶段基本任务后，我们一边着手解决碰到的问题，基于我们对菘蓝不同发育阶段直铁线莲宁B的积累规律探索，改用直铁线莲宁B含量比较明显的两个时期的菘蓝根部作为比较转录组和miRNA组的研究，测序结果和后续分析仍在进行当中。与此同时我们建立了菘蓝毛状根体系作为我们的研究平台，主要开展了两个方面的研究：（1）构建了直铁线莲宁B生物合成关键节点基因HCT基因的毛状根，探讨通过代谢流的导向，促进目标化合物直铁线莲宁B的生物合成；（2）直铁线莲宁B生物合成关键糖基转移酶的鉴定。已取得主要进展包括：（1）通过过表达验证了IiHCT是直铁线莲宁B生物合成关键基因基因之一，并获得直铁线莲宁B高产的IiHCT过表达毛状根；（2）通过基本转录组信息，我们克隆了14个候选糖基转移酶基因，实验验证了其中3个基因可能是参与直铁线莲宁B生物合成的关键基因，在直铁线莲宁B生物合成途径的解析上取得了重要进展。转基因毛状根构建结果显示，这三个基因均参与了直铁线莲宁B的生物合成途径并负责相应化合物的糖基化修饰。其中UGT236和UGT142分别主要负责松柏苷和松脂素二葡萄糖苷的合成。UGT142、UGT146、UGT236都参与直铁线莲宁B的合成，但UGT146可能起关键作用。总之， 本研究鉴定了一个参与直铁线莲宁B生物合成的节点基因和三个UGT基因，为今后构建抗病毒成分直铁线莲宁B这类化合物高产的菘蓝品种或生物反应器奠定了很好的基础。