沉默信号长距离传递对植物的生长发育和抗病有着非常重要的作用。我们前期利用一些表观遗传因子突变体（如PolV，DRD1）研究，发现PolV-DRD1途径参与诱导DNA甲基化和沉默信号的产生，并负调控内源基因的系统沉默。后期的研究发现Pol V-DRD1同一支路上的关键蛋白-DCL3-突变体的沉默表型与Pol V和DRD1的突变体不一致，利用DCL3已知的功能不能解释其突变表型，表明DCL3在调控基因沉默途径存在尚未知晓的功能。我们初步实验结果表明DCL3除了参与产生24-ntsiRNAs，在基因沉默长距离信号的传递上有重要的作用。该项目将深入探究DCL3对长距离沉默信号的作用机制；探究DCL3在DNA甲基化和沉默信号长距离传递的功能分化，力求阐明其对植物基因沉默的表观遗传信息的建立和维持的生物学功能和意义及其作用分子机理。

In plants, a non-cell autonomous RNA silencing spreading from cell-to-cell and throughout the whole plant plays important roles in developmental and defensive processes. In previous study, by using a reported chemical-inducible RNAi system, we revealed that Pol V-DRD1 -dependent RdDM required to reinforce self-silencing of exogenous silencing inducer may play a role to prevent inappropriate silencing of the endogenous target transcript in wild-type plants. Subsequently, we found that mutation of another RdDM component, DCL3, produced distinct silencing phenotype from that of pol v and drd1 mutants, suggesting that DCL3 might have multiple functions in regulation of silencing pathway. Our previous results suggest that，in addition to production of 24-nt siRNAs, DCL3 might also play functional role in long distance spreading of silencing signal. In this research, we will further investigate involvement of DCL3 in the long distance movement of silencing signal, aiming to understand the molecular basis and functional differentiation of DCL3 in regulation of DNA methylation and spreading of gene silencing signal in plant.

前期利用可诱导PDSi系统意外发现表观遗传途径同一支路上的关键蛋白(DCL3)突变体的非自主性沉默（沉默信号的传递）表型与其他蛋白突变体的表型不一致，利用其已知的功能不能解释其突变表型，表明DCL3除了参与产生24-ntsiRNAs，存在尚未知晓的功能。本项目获得PDSi转基因植株与DCL3点突突变体dcl3-5杂交的纯合杂交后代（dcl3-5/PDSi），验证其不发生非自主性沉默。并将全长的DCL3 cDNA及可能的功能结构域回补到dcl3-5/PDSi植物，获得了不同恢复诱导沉默表型的互补植株，初步生物学实验验证其并非依赖24-nt的产生，暗示原先认为DCL3存在其他功能的预测是正确的。为了进一步证明各结构域的功能，对互补植株进行后代纯合体的筛选，将纯合体植物进行siRNA测序和甲基化分析。目前正在等待测序结果，一旦获得分析结果将进行论文撰写，阐述DCL3在DNA甲基化和沉默信号长距离传递的功能分化及其作用分子机理。 同时，利用抑制子2b结合不同长度的siRNA的特性，在全基因组水平将2b结合的siRNAs和2b转基因植物中甲基化发生变化的区域进行比对，发现一些21-22 nt siRNAs参与DNA的甲基化；Southern 杂交实验表明，一些多拷贝数TEs甲基化降低可能诱导其拷贝数的变化。 另外，我们发现AGO蛋白能与结合了siRNA的2b稳定互作并改变2b的核仁定位；但2b和AGO结合反过来抑制了RDR介导的抗病RNA沉默。研究结果揭示了植物表观遗传途径和沉默抑制子复杂的多层次的抗病应答响应。