以肿瘤坏死因子受体相关因子6的RING-Zn结构域（RZ-TRAF6）为抗癌药物靶点的研究目前尚未见报道，此区域所控的信号调控网络及对免疫等的影响也尚不十分清晰。在申请人前期工作的基础上，本研究旨在确定RZ-TRAF6为抗癌药新靶点并阐明其下游信号通路的网络调节及毒副作用，为抗癌治疗提供新途径。（1）证明靶点的特异性，通过模拟计算选出靶向此靶点的化合物，验证其在体内外抗癌活性；检测化合物对此靶点突变细胞系及TRAF6与泛素结合酶复合物Ubc13结合的影响，通过荧光标记化合物直接确认与TRAF6的结合，并以琼脂糖6B接合化合物以捕获细胞内蛋白，反向证明靶点特异性。（2）通过探讨化合物对转化生长因子活化激酶1（TAK1）和蛋白激酶B（AKT） 的活性及其下游NF-κB、p38MAPK和mTOR等信号通路的影响，阐明靶点的信号转导调控网络。（3）运用动物实验探讨化合物对免疫和其它系统的毒副作用。

Tumor necrosis factor (TNF)-Receptor Associated Factor 6（TRAF6） together with the ubiquitin-conjugating enzyme complex Ubc13 simultaneously activating tumor-associated factor Protein kinase B (AKT) and TGF-β-activated kinase 1 (TAK1), to block this effect, the present study is intended to TRAF6 in RING-Zn domain (RZ) as an anti-cancer the new drug targets, and to clarify its mechanism. To determine the target and specificity, we employed computational docking program to select small molecules that can bind with RING-Zn domain of TRAF6 (RZ-TRAF6，and verify its anticancer activity in vitro and in vivo; detecting the effects of compound on targets a mutant cell line and binding of TRAF6 and Ubc13; fluorescently-labeled compounds bind to confirm the TRAF6 protein directly; and compounds capture intracellular protein, proof target specificity from the opposite direction. Clarify its regulatory networks through that Investigate the effect of compounds on the activity of TAK1 and AKT and its downstream NF-κB, p38MAPK and mTOR signaling pathway. Furthermore, explore the compounds on the immune system and other side effects by animal experiments. Previous studies demonstrated preliminary, compounds can inhibited the activation of TAK1 and AKT, this compounds was selected targeting RZ-TRAF6 by computational docking program, and its have anti-cancer activity and low toxicity In vitro and in vivo. This study will determine RZ-TRAF6 as a new target for anti-cancer, to clarify the signal pathway network, provide a new way for cancer treatment.

本研究目的为验证以肿瘤坏死因子受体相关因子6的RING-Zn结构域（RZ-TRAF6）为抗癌药物靶点，并阐明此区域所控的信号调控网络及对免疫等的影响。研究结果基本确定了RZ-TRAF6为抗癌药物靶点及其特异性，基本阐明了化合物与 RZ-TRAF6结合的作用机制。首先，通过体内外实验证明了4种化合物通过竞争性结合预期靶点，达到了抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡的作用，并通过荧光标记化合物验证了化合物与细胞内TRAF6的结合。基本阐明了RZ-TRAF6下游相关通路之间的调节网络，完善此结构域对肿瘤生长的控制机制的理论研究。我们发现通过4种化合物的作用发现竞争性抑制此靶点后，抑制了TRAF6下游的转化生长因子活化激酶1（TAK1）和蛋白激酶B（AKT）的泛素化及磷酸化水平，从而提高凋亡因子Bax/Bcl的水平而诱导了肿瘤细胞凋亡。另外，动物实验证明了4种化合物没有急性毒性，而且，提高了T细胞的百分比，并没有影响CD4+T/CD8+T的比值，还增加了TNF-α，IFN-γ和IgG的分泌，说明，以化合物竞争性结合RZ-TRAF6不仅没有影响TRAF6的免疫功能，还提高了免疫功能。申请了4篇专利；在国际、国内期刊上发表论文4篇。人才培养：硕士研究生4名、博士研究生1名。 本研究预期确定TRAF6的RING-Zn 结构域为抗癌药物靶点，证明其特异性，阐明化合物与 RING-Zn 结构域结合的分子机制，当初申请研究经费70多万元，经审核批得到研究经费10万元，期限为一年，虽然时间紧任务重，但我们克服困难，并借用了部分经费，基本达到了当初预期的研究成果，圆满完成了合同书的内容。