牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒（BVDV）引起的一种烈性传染病。BVDV感染宿主后，病毒大量复制是其治病的直接原因，但其致病机制目前尚不清楚。前期研究发现亲环蛋白A（CyPA）特异性抑制剂环孢素A（CsA）和CyPA多抗抑制CyPA的活性后使BVDV复制能力显著降低。为了阐明CyPA调控BVDV复制的分子机制，本项目拟利用RNA干扰、CRISPR/Cas9 基因敲除和蛋白过表达技术调控CyPA的表达以明确CyPA对BVDV复制的影响；通过pull-down、免疫共沉淀、Western-blot等方法阐明与CyPA互作的病毒蛋白，构建与CyPA互作的BVDV蛋白的截短突变体，鉴定与CyPA互作的病毒蛋白的结构域；通过构建蛋白截短或点突变的CyPA突变体，确定与BVDV蛋白作用的CyPA功能区，从而揭示CyPA促进BVDV复制的分子机制，为研发BVDV新型疫苗和抗病毒药物提供理论依据。

Bovine Viral Diarrhea is an infectious disease caused by bovine viral diarrhea virus (BVDV). It is known that virus-host interaction plays a key role in the viral replication and pathogenesis and efficient replication of BVDV is necessary for the viral pathogenesis, therefore, understanding the mechanism of BVDV replication is helpful for the development of prevention and control strategies of BVD. Based on the previous study in our lab, we firstly found that inhibition of cyclophilin A (CyPA) by its specific inhibitor cyclosporine A (CsA) or anti-CyPA polyclonal antibody significantly suppressed the replication of BVDV in vitro, suggesting the positive role of CyPA in the viral replication. In the present project CyPA expression was modulated by RNAi ,CRISPR/Cas9 or protein overexpression to determine the effect of CyPA on the viral replication. To elucidate the regulatory mechanism of BVDV replication by CyPA, techniques such as pull-down, Co-immunoprecipitation and western-blot were used to explore the CyPA-interacting BVDV proteins.Further, the interaction domain of which was determined by analyzing the interaction between CyPA and truncated mutants of CyPA-interacting viral proteins.Further more, truncated mutants or point mutations of CyPA were constructed to analyze the functional domain of CyPA interacting with BVDV proteins. This study will provide a theoretical basis for the development of novel efficient vaccines and antiviral drugs against BVDV.

牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus, BVDV）引起的一种传染性疾病，其常见的感染宿主为牛、猪、羊、鹿、骆驼和反刍野生动物。牛病毒性腹泻在临床上表现为高热、腹泻、白细胞减少、免疫抑制、呼吸障碍、急慢性黏膜病等，该病的死亡率为90%～100%。BVDV已被世界动物卫生组织（OIE）列入OIE疾病名录。目前，该病在世界范围内频发，给动物养殖业造成巨大经济损失，为此，急需疫病控制的理论突破与新的技术支持。病毒是严格细胞内寄生的微生物，其完全依赖宿主生命维持系统来完成其生命周期，因此，宿主因子对于病毒复制、蛋白翻译以及子代病毒的释放是必不可少的。 本项目利用CyPA的抑制剂CsA和CyPA多抗孵育MDBK细胞后再进行BVDV感染，发现感染细胞能力显著下降，用BVDV标准株进行同样的实验，得到了相似的结果。为了澄清CyPA在 BVDV感染过程中发挥的作用，本研究采用BVDV感染过表达和下调表达内源性CyPA的细胞系，通过TCID50、Real-time RT-PCR、Western-blot等方法，明确CyPA对病毒早期复制的影响；通过pull-down、核定位、免疫共沉淀、激光共聚焦、免疫荧光、Western-blot 等方法阐明BVDV的NS5A蛋白与CyPA的互作关系，并通过CyPA蛋白截短的手段找到了CyPA与BVDV NS5A非结构蛋白互作的功能区在126位氨基酸谷氨酰胺上。当该氨基酸突变为亮氨酸时CyPA丧失了与NS5A结合的能力，当用CyPA蛋白对突变的CyPA进行拯救，无法恢复其功能，表明CyPA功能氨基酸的突变是不可逆的。 通过CyPA蛋白与NS5A互作，揭示CyPA在BVDV感染过程中的通过126位的氨基酸与BVDV NS5A蛋白结合发挥起促进BVDV病毒复制的作用机制，为研发BVDV新型疫苗和抗病毒药物提供分子靶标和理论依据。