本课题从促进血脑屏障（BBB）生理性可逆开放、增强肿瘤细胞主动靶向及抑制多药耐药三个角度出发，旨在解决前期研究中遇到的“脂质体只能有限延长荷瘤小鼠的生存时间，而不能实现部分或全部治愈”的问题。项目拟采用DSPE-PEG2000-RGD为主动靶向配体，以粉防己碱为多药耐药抑制剂，以长春新碱为抗肿瘤药物，构建全新的主动靶向抗耐药脂质体。首先利用具有“引药入脑”功效的中药“开关”药对调节机体BBB可逆开放，增加脂质体在脑组织中分布；其次借助RGD肽与整合素受体的特异性结合，将药物主动介导至肿瘤细胞中，使载体实现对肿瘤细胞主动靶向；最后利用粉防己碱抗多药耐药性质，抑制肿瘤细胞膜表面P-gp外排蛋白的表达，提高肿瘤对药物的敏感性。本课题以中医药理论为基础，结合现代主动靶向给药技术，重点阐述中药调节BBB的物质基础，探讨主动靶向及抗多药耐药的作用机制，为拓展中医药在临床抗肿瘤方面应用提供新的理论依据。

The aim of this study is to resolve the problem “Liposomes could only prolong the survival time of tumor-bearing mice limitedly, while they cannot achieve some or all of the cure” from the promotion the reversible opening of blood brain barrier (BBB), the enhancement of active targeting to tumor cells and the inhibition of multidrug resistance (MDR). The active targeting anti-resistant liposomes will be modified with DSPE-PEG2000-RGD as the targeting ligand, entrap with tetrandrine as the multidrug resistance inhibitor, and encapsulate vincristine as the anticancer agent. Firstly, the reversible opening of BBB will be regulated by the “On-Off” traditional Chinese medicine parter, and the distribution probability of drugs in brain tissue is increased accordingly; Secondly, The drugs are transported to tumor cells actively and the effect of active targeting will be achieved in virtue of the combination of RGD and integrin receptor; In the end, the P-gp efflux pump is inhibited and the sensitivity of anti-cancer drugs is improved via the inhibiting MDR ability of tetrandrine. The studies are based on the theory of traditional Chinese medicine, and combine with modern technology of targeting drug delivery. They emphasis on the material basis of regulation the BBB, the mechanism of inhibiting MDR and active targeting. The studies will provide theoretical and experimental bases for the expending clinical application of traditional Chinese medicine.

本课题首先建立了体外血脑屏障（BBB）模型，以BBB模型的通透性为指标分别考察了石菖蒲和苏合香饮片水提取液、无水乙醇提取液和药材挥发油对BBB功能的影响，并采用星点设计-效应面法优选了石菖蒲和苏合香药材挥发油的提取工艺。课题采用RGD肽中的胺基与功能磷脂中的NHS进行酰化反应制备靶向配体DSPE-PEG2000-RGD，以薄膜分散法和硫酸铵梯度法制备脂质体，采用星点设计-效应面法优选了RGD修饰异长春花碱与粉防己碱脂质体的最佳处方并确定了制备工艺。采用粒度分析仪、电子透射电镜和原子力扫描探针显微镜对脂质体的粒径及外观进行了表征，采用HPLC法测定了脂质体的包封率和体外释放度，分别建立了脂质体中异长春花碱和粉防己碱的HPLC含量测定方法。采用HPLC分别考察了脂质体在小鼠脑胶质瘤C6、C6/ADR细胞中的摄取情况，采用激光共聚焦显微镜法考察了脂质体中的荧光探针在C6、C6/ADR细胞中的分布情况，采用SRB法考察了各种脂质体对C6、C6/ADR细胞的细胞毒性，考察了不同脂质体跨越BBB的能力。以硫酸长春新碱为内标考察了药物的不同制剂在SD大鼠中的代谢动力学。分别以生存状态、生存曲线和病理切片为指标考察了脂质体在荷瘤小鼠中的药效学。结果优选了石菖蒲和苏合香药材中挥发油作为调节机体BBB的有效部位，并优选出了挥发油的最佳提取工艺参数。通过质谱鉴别和薄层色谱鉴别显示了靶向配体分子的成功合成。课题所构建的RGD修饰异长春花碱与粉防己碱脂质体具有大小合适的粒径、适宜的粒径分布、稳定的表面电位、较高的药物包封率、缓慢的体外释放度以及恒定的药物含量。荧光显微镜和HPLC实验研究结果表明RGD修饰异长春花碱与粉防己碱脂质体可以显著增加荧光探针在脑胶质瘤C6、C6/ADR细胞中的分布，细胞毒实验结果显示了相同的作用趋势。动物体内药动学研究表明与游离的异长春花碱相比，RGD修饰异长春花碱与粉防己碱脂质体的t1/2α、t1/2β、AUC（0-24 h）和AUC（0-∞）分别提高了3.00、6.27、30.44和26.14倍，实现了脂质体的长循环作用，同时可以更好的发挥载体的EPR效应。药效学研究表明RGD修饰异长春花碱与粉防己碱脂质体可以明显改善小鼠的生存状态、显著延长荷瘤小鼠的生存时间，同时病理学检识结果表明RGD修饰异长春花碱与粉防己碱脂质体可以明显诱导肿瘤细胞的体内凋亡过程。