本研究目标是阐明p63基因变异体TAp63γ在骨骼发育尤其是软骨内成骨中的新的功能与机制。P63 是P53 转录因子家族的重要成员。此前的研究揭示了P63对于机体的上皮和心脏发育的重要性，因为p63 基因敲除小鼠的上皮缺损且伴有严重的心脏缺陷。值得注意的是p63 基因缺失小鼠的骨骼缺陷，即肢体缺如或严重缩短。同时，人P63 基因突变也会引起肢体和指节异常。这些观察提示P63 在骨骼发育，尤其是软骨内成骨中的潜在功能。然而，小鼠p63有8种变异体。这些变异体与骨骼发育的关联目前知之甚少。基于我们前期对p63变异体的研究，我们推测TAp63γ 是控制长骨发育的效应p63变异体。我们将在体外研究TAp63γ如何影响软骨细胞分化、成熟, 为进一步了解骨骼生长发育与疾病的机理打下基础。

The overall objective of this project is to determine the novel function and mechanism of a p63 variant, TAp63γ, controlling endochondral bone formation during skeletal development. p63 is a critical member of the p53 family of transcription factors. Previous studies have demonstrated the importance of p63 during epithelial and cardiac development, as p63 mice lack epithelia and have severe cardiac defect. Notably, p63 deficient mice have severe skeletal defect with absent or truncated limbs, while humans with P63 mutations also show limb and digit abnormalities. These observations suggest a potential function of p63 during skeletal development, especially during endochondral bone formation. However, mouse p63 is consisted of eight variants, how these variants link to bone development is currently largely unknown. Here, based on results of our previous studies on p63 variants, we hypothesize that TAp63γ is the responsible variant that plays essential roles during long bone development. We propose to characterize the in vitro function of TAp63γ during chondrogenesis to further our understanding of the mechanism of skeletal development and disease.

已知，人类P63 基因家族成员与机体的发育与肿瘤发生密切相关。小鼠p63 基因敲除后，除了严重的上皮和心脏缺陷外，其骨骼缺陷也十分明显，表现为肢体缺如或严重缩短。这表明p63 在小鼠四肢长骨的发育，即软骨内成骨中起重要作用。p63 基因有TAp63-α/β/γ和△NP63-α/β/γ等多种变异体，分别编码N端以及C端结构域完整或缺失的p63蛋白异构体。我们此前的研究表明TAp63-α和△NP63-α对于小鼠肢体发育的作用有限。进一步的研究发现γ变异体，尤其是TAp63γ在软骨细胞肥大成熟时表达升高。由于软骨细胞肥大成熟是软骨内成骨的关键环节，是肢体长骨生长的原动力，因此，我们推测TAp63γ可能对小鼠四肢长骨的发育至关重要。本应急项目应用小鼠软骨细胞模型 MCT 和 ATDC5 细胞检测TAp63γ如何影响软骨细胞的分化与成熟, 为深入研究TAp63γ与体内骨骼生长发育与疾病发生的机理提供重要的理论和实验依据。一年来，我们成功地建立了分别由CMV(CMV-TAp63γ)和肥大型软骨细胞特异的Col10a1 基因启动子驱动(ColX-TAp63γ)的稳定表达TAp63γ的ATDC5细胞系。与载体及空白对照组相比，TAp63γ稳定细胞株中Col10a1 基因上调。碱性磷酸酶以及茜素红染色增强，提示TAp63γ促进软骨细胞成熟及基质矿化。我们还在MCT细胞系中过表达TAP63γ和进行其siRNA干扰研究。结果显示TAp63γ过表达，并不能明显上调Col10a1 基因的表达。而在MCT细胞系中干扰TAP63γ的效率极低，对Col10a1 基因表达的影响也不稳定。表明MCT细胞系用于瞬时转染研究的局限性以及TAp63γ SiRNA干扰片段有待优化选择。此外，我们还进行了TAp63γ 基因的获得性功能研究。我们成功地建立了在肥大型软骨细胞中过表达TAp63γ的转基因小鼠品系。对新生小鼠骨骼生长版表型的初步分析表明，TAp63γ 小鼠的肥大型软骨细胞区域增长。进一步研究TAp63γ如何影响体内软骨内成骨及其发生机制，必将有助于我们深入理解机体的骨骼发育并为相关骨骼疾病的防治提供重要的理论依据和治疗靶点。