小胶质细胞向M2表型转化是促进脑缺血后少突胶质前体细胞增殖分化、调控髓鞘再生，减轻白质损伤的关键因素。生长因子是人体内源性多肽，通过与特异的细胞膜受体结合对细胞增殖和分化具有明确的调控作用，促红细胞生成素（Erythropoietin, EPO）正是一个非常理想的选择。我们构建单位点突变EPO（M-EPO）使其丧失促红细胞活性，避免了其应用脑缺血治疗的副作用；同时前期研究已经证实，M-EPO也具备促进神经血管新生作用。因此，本项目主要应用离体和活体模型研究促进脑缺血恢复期小胶质细胞向M2表型极化和白质修复的关键机制，验证假说：M-EPO通过激活JAK2-STAT3通路，调节小胶质细胞和巨噬细胞向M2表型极化，从而促进少突胶质细胞新生及髓鞘再生修复白质损伤，最终改善脑缺血神经功能，为M-EPO临床转化提供重要证据。

Microglial polarization toward the beneficial M2-like phenotype has recently been shown to be important for oligodendrocyte precursor cells differentiation and the process of remyelination. Polypeptide growth factors play a vital role in regulating cell proliferation and differentiation through the specific cell membrane receptors, erythropoietin (EPO) might be the ideal choice. We constructed the mutant EPO (M-EPO) containing a single amino acid mutation within the erythropoietic motif, which completely lacks erythropoietic and platelet-stimulating side effects whereas retains both angiogenesis and neurogenesis effects. Therefore, this study using the aged cerebral ischemic mice and the oxygen and glucose-deprived microglia elucidates the hypothesis: M-EPO may mediate neuroprotection through activating JAK2-STAT3 signaling pathways, promoting microglial polarization toward the M2-like phenotype following stroke, resulting in remyelination, white matter repair and finally improve neurological recovery after stroke. Our investigation will provide a reliable basis for clinical trials of M-EPO.

我们之前的研究已经证实了一种无促红细胞生成功能的新型变构促红细胞生成素（mutant erythropoietin, MEPO）可以在脑缺血损伤后起到神经保护作用。本课题我们继续验证MEPO在脑缺血后是否促进白质损伤的修复，以及是否通过Janus激酶2/信号转导和转录激活子3信号通路（JAK2/STAT3 signaling pathway）发挥保护作用。雄性中年C57BL/6小鼠（8月龄）通过线栓法制作大脑中动脉栓塞模型（middle cerebral artery occlusion, MCAO)，插栓脑缺血45分钟后拔出线栓使血流再通。再灌注后通过腹腔注射的方式按照5000U/kg体重每日给予MEPO和等体积的生理盐水。在MCAO模型制作前半小时按照3mg/kg体重的剂量腹腔注射JAK2/STAT3信号通路的抑制剂—AG490，再灌注后每日注射至实验结束。采用平衡木试验和贴纸试验评估小鼠脑缺血后1、2、5、7、10、14天的神经功能。通过TUNEL检测脑缺血后1天的神经元凋亡。通过免疫组织化学荧光染色检测脑缺血后14天的脑白质完整性和小胶质细胞表型变化。按照50mg/kg体重的剂量每日腹腔注射BrdU，用以检测小鼠脑缺血后少突胶质细胞新生。我们的研究结果显示，脑缺血损伤诱导神经元凋亡、小胶质细胞激活，并且促进小胶质细胞向M1表型转化。MEPO显著减少神经元凋亡，诱导小胶质细胞向M2表型转化，从而增加少突胶质细胞新生（P<0.05）。这些变化可能是MEPO减轻脑组织丢失体积，降低白质损伤，并且改善脑缺血小鼠的神经功能的原因（P<0.05）。值得注意的是，MEPO诱导M2小胶质细胞活化以及白质修复的功能被AG490完全消除，提示MEPO促进小胶质细胞从M1向M2转化的能力很可能是通过JAK2/STAT3通路所介导的。综上所述，我们的研究显示MEPO可以在脑缺血损伤后保持白质结构完整性，可能的机制是MEPO通过激活JAK2/STAT3信号通路诱导小胶质细胞向M2表型转化，从而增加少突胶质细胞新生，促进白质修复。我们的研究揭示了MEPO促进小胶质细胞表型可能的内在机制，并且为其后用于治疗缺血性脑卒中提供了科学依据。