坏死性凋亡是一种caspase非依赖的可调控的细胞程序性坏死途径。课题组前期研究结果发现内质网应激蛋白GRP78能够与坏死性凋亡关键分子受体相互作用丝氨酸-苏氨酸激酶3（RIP3）直接结合。课题组认为GRP78与RIP3相互作用，能影响RIP3与其他分子的结合，从而调节坏死性凋亡通路。课题组拟首先在胃癌细胞中分析GRP78与RIP3之间相互作用的关系以及二者在化疗药刺激模型中与坏死性凋亡的关系；接着在胃癌组织中检测GRP78、RIP3及相关分子的表达，分析其表达与胃癌临床病理因素以及化疗药抵抗的临床相关性；最后建立裸鼠胃癌模型，验证上述实验的结果。该课题将为阐明GRP78通过调节RIP3的功能而调节坏死性凋亡通路，增强胃癌细胞的化疗药抵抗的新的机制，为胃癌的临床治疗提供新的实验依据。

Necroptosis is a caspase-independent programmed cell death pathway. Recent researchs show that both chemical drug and endoplasmic reticulum stress (ERS) can induce necroptosis. GRP78 is ubiquitously expressed in the ER and is activated during ERS. GRP78 can alleviate or abort the ERS reaction to restore homeostasis within the cell, thus GRP78 is chemoprotective. Our previous study shows that GRP78 can interact with receptor interacting protein 3(RIP3). RIP3 is the key elements in the necroptosis pathway. Research Group believes that GRP78 can interact with RIP3 and effect the function of RIP3, thus regulate the pathway of necroptosis. First, the relationship between GRP78 and RIP3 will be tested in gastric cancer cell lines, as well as their relationships with necroptosis in the chemotherapy drugs stimulating cell mode.Then the research group intends to examine the expression of GRP78, RIP3 and related molecules in gastric carcinoma and analyze the clinical relevance between their expression and chemotherapy resistance. Finally we will establish gastric nude model and verify the results of the above experiments. The study aim to clarify the impact of GRP78 on the function of RIP3 in necroptosis pathways, and GRP78 can enhances chemotherapeutic drug resistance of gastric cancer cells. The investigation will provide new experimental evidence for the clinical treatment of gastric cancer.

胃癌细胞的多药耐药现象是导致胃癌总体疗效不理想的重要原因。项目的研究目的是探讨GRP78、RIP3的相互作用及RIP3对胃癌化疗药治疗效果的影响。项目首先利用免疫印迹分别检测了GRP78和RIP3在胃癌细胞及组织中的表达情况，发现在胃癌细胞和组织中GRP78高表达，而RIP3低表达。采用了免疫组化染色方法来检测GRP78和RIP3在172例胃癌患者的组织芯片中的表达及定位，结果显示GRP78在癌组织中高表达，癌旁组织中低表达，胞浆定位为主；RIP3在癌组织低表达，癌旁组织中高表达，核定位为主。统计结果显示GRP78和RIP3均与胃癌患者的TNM分期和淋巴结转移差异有具有统计学意义（P＜0.05）。随后利用免疫共沉淀检测并验证在工具细胞及胃癌细胞中GRP78可以与RIP3相互作用。接着使用5-FU和Z-VAD同时处理MKN28和MGC803细胞，通过MTT检测细胞生存及蛋白免疫印迹检测PARP/c-PARP/caspase3/c-caspase3的表达，发现在MGC803细胞中Z-VAD的加入抑制了5-FU的诱导效果，而MKN28细胞在Z-VAD加入后细胞死亡程度更加明显，并且不依赖于c-PARP/c-caspase3。随后通过流式细胞术检测凋亡细胞比例以及蛋白免疫印迹检测坏死通路指标性分子（RIP3/p-RIP3/MLKL/p-MLKL）的蛋白水平表达变化。在Z-VAD和5-FU共处理后，MKN28细胞凋亡程度增加，RIP3、p-RIP3及p-MLKL表达也明显增加，进一步确定了MKN28发生坏死性凋亡。随后对MKN28细胞转染HA-RIP3，提高RIP3在胃癌细胞中的蛋白水平后，利用流式细胞术检测细胞死亡的程度，发现MKN28细胞的死亡数目增加，从而表明MKN28细胞对5-FU和Z-VAD的共处理更加敏感。综上所述，项目的研究结果显示，GRP78和RIP3在胃癌细胞内存在相互作用，并且两者均与胃癌患者的TNM分期和淋巴结转移有相关性，同时上调RIP3的表达可以提高胃癌细胞对5-FU和Z-VAD处理的敏感性。按照合同约定，课题研究成果以论文形式提交。在该基金共资助下，目前已发表论文2篇（均为SCI收录），培养硕士研究生1名。