申请人课题组最近开发了基于CRISPR/Cas9的DNA片段编辑新技术方法，发现绝缘子结合蛋白CTCF和染色体粘联蛋白Cohesin介导的特异性DNA环化对于原钙粘蛋白细胞“克隆特异性”表达的启动子选择和激活非常重要，进一步研究发现哺乳动物基因组中CTCF结合位点一维序列的方向性决定基因组三维染色质高级拓扑结构，这一重要发现刚刚被Cell杂志接受（Cell接受函见附件）。在本重大研究计划一年期集成项目中，我们将利用CRISPR分子遗传学DNA片段编辑方法并结合染色体构象捕获（3C/4C/5C ）技术研究细胞重编程过程中非编码核酸增强子、启动子和绝缘子之间的相互作用，阐明染色质高级拓扑结构中非编码核酸相互作用调控基因表达的机制。

We recently developed an efficient DNA fragment editing method for mammalian regulatory DNA elements and gene clusters by CRISPR/Cas9, and found that specific DNA-looping interactions mediated by CTCF and Cohesin are required for the promoter choice in combinatorial expression of protocadherin family genes. Further studies revealed that the location and relative orientation of genome-wide linear one dimensional (1D) sequence of CTCF binding sites determines the 3-dimensional (3D) topological chromatin architecture (This interesting finding has just been accepted for publication by Cell, the acceptance letter is in the attachment file). In this grant application, we will dissect the long-distance DNA interactions between promoters and enhancers as well as insulators by molecular genetics and 3C/4C/5C methods and investigate mechanisms by which directional CTCF binding determines chromatin topological folding and enhancer insulation for promoters during cell reprograming. These studies have important implications regarding the architectural role of noncoding DNA sequences in 3D topological chromosomal folding of mammalian genomes.

1. 摘要。 核染色质在细胞核内形成层次分明的拓扑结构域。在不同的拓扑结构域中，基因的不同调控元件之间形成染色体环化，这种环化与基因转录密切相关，但染色质拓扑结构调控基因表达的机理还不清楚。染色质结构蛋白在拓扑结构形成中起到关键作用，如CTCF和Cohesin复合体，主要结合在非编码核酸调控区，并通过染色质高级结构调控基因表达。我们发现CTCF/Cohesin结合调控区的一维序列决定基因组的三维结构。本研究选取原钙粘蛋白Pcdh复杂基因簇为研究对象，研究远距离的非编码DNA调控元件启动子、增强子、绝缘子之间相互作用在染色质高级结构域中的动态变化，以及其调控基因表达的机制。我们选取小鼠中的非编码DNA调控元件，利用基因编辑技术将调控元件整合到Pcdh基因簇中，改变原有基因增强子与启动子的互作。我们通过染色质免疫共沉淀，构象捕获等实验分析整合调控元件对原有染色质三维空间结构的作用，以及基因表达的改变。我们发现了能够改变原有染色质空间构象的调控元件，以及在其中发挥作用的关键因子。这些结果为阐释增强子、绝缘子作用机理，以及哺乳动物基因组高级拓扑结构及基因表达调控的机理提供了新的见解。