基于白念珠菌肠道感染的研究现状、灰树花多糖的免疫调节作用以及项目组前期工作基础，申请者提出“灰树花多糖可通过调控肠组织TLR2和TLR4的表达，影响局部炎症细胞因子及趋化因子的释放，干预治疗脾虚证肠道白念珠菌的感染”假说。①采用培养法检测大便载菌量，用光、电镜检查鼠肠黏膜的病理变化，分析灰树花多糖对白念珠菌感染脾虚小鼠病情的影响。②采用实时定量RT-PCR检测肠组织TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α和IL-10 mRNA表达；Western-blot检测肠组织TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α和IL-10的蛋白表达；ELISA法测定肠组织IL-1β、IL-6、IL-8、MCP-1的表达。旨在揭示机体抗白念珠菌感染的相关分子免疫机制，以及灰树花多糖对白念珠菌肠道感染脾虚小鼠的干预作用，为临床防治白念珠菌感染和脾虚证提供一定的理论依据。

We present a hypothesis that "grifola frondosa polysaccharide can affect the release of inflammatory cytokines and chemokines in local intestinal tissue through the regulation of TLR2 and TLR4 expression, which can treat spleen deficiency mice with the Candida albicans infection". This hypothesis is based on the research status of intestinal infection by Candida albicans, the immunoregulation effect of grifola frondosa polysaccharide and our prophase work. ①To detect bacterium capacity of excrement by culture method, and observe pathological changes of mice intestinal mucosa by light and electron microscope, as well as analyze the effect of grifola frondosa polysaccharide on spleen deficiency mice infected by Candida albicans. ②To detect mRNA expression of TLR2, TLR4, MyD88, NF-κB, TNF-α and IL-10 in intestinal tissue by real-time quantitative RT-PCR method; to examine protein expression of TLR2, TLR4, MyD88, NF-κB, TNF-α and IL-10 in intestinal tissue by Western blot; to measure the content of IL-1β, IL-6, IL-8, MCP-1, etc. in intestinal tissue by ELISA method. Our aim is to reveal the interrelated molecular immune mechanism of body's resistance to Candida albicans infection, and the intervention of grifola frondosa polysaccharide on spleen deficiency mice with intestinal infection caused by Candida albicans, which can provide basis for the prevention and clinical treatment of the infection.

近年来，念珠菌病有增多趋势，但肠道念珠菌群失调与中医脾胃病证关系的研究甚少。本项目围绕“灰树花多糖可通过调控肠组织TLR2和TLR4的表达，影响局部炎症细胞因子及趋化因子的释放，干预治疗脾虚证肠道白念珠菌的感染”的假说进行了研究。主要研究方法和内容包括：①采用培养法检测大便载菌量，用光、电镜检查鼠肠黏膜的病理变化，分析灰树花多糖对白念珠菌感染脾虚小鼠病情的影响。②采用实时定量RT-PCR检测肠组织TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α和IL-10 mRNA表达；ELISA法测定肠组织IL-1β、IL-6、MCP-1的表达水平；用流式细胞仪检测了小鼠肠组织CD4 +T细胞和CD8+T细胞；用荧光显微镜检测了小鼠小肠黏膜组织中穿孔素阳性细胞的表达水平。结果显示，正常小鼠感染白念珠菌后，脾虚感染白念珠菌的小鼠粪便载菌量显著增高，有显著性差异（p<0.01），小肠局部黏膜形态学改变及上皮细胞超微结构的病理变化明显；小肠组织中IL-1β、IL-6、MCP-1等细胞因子及趋化因子的含量及肠组织中TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-10 mRNA表达水平均有不同程度改变，且有统计学意义。灰树花多糖干预后，可降低肠组织中TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-10 mRNA表达水平，以及减少IL-1β、IL-6、MCP-1等的释放。此外，与A组比较，脾虚模型组（B组）、正常感染组（C组）及脾虚感染组（D组）小鼠小肠黏膜固有层的CD4+T/CD8+T比值有不同程度变化；B、D组穿孔素与D组颗粒酶阳性细胞数量明显增多；D组与B、C组比较，CD4+T/CD8+T比值均降低（p<0.01），穿孔素和颗粒酶阳性细胞数量均增多。本研究揭示机体抗白念珠菌感染的相关分子免疫机制，以及灰树花多糖对白念珠菌肠道感染脾虚小鼠的干预作用，为临床防治白念珠菌感染和脾虚证提供一定的理论依据。