炎症与损伤持续敏化TRPV1是神经病理性疼痛治疗困难的关键原因。豆腐果苷是源自云南民间常用山龙眼属植物的民族药，抗神经病理性疼痛作用显著，但作用靶点及机制尚未明确。申请者结合前期研究基础提出假设：豆腐果苷通过外周感觉神经特有的负反馈调控机制“GABA介导的TRPV1去敏化”，拮抗炎性因子和神经损伤的持续敏化，阻断“疼痛→炎症→持续疼痛”循环，从而产生抗神经病理性疼痛作用。本项目拟分别从离体与在体水平建立神经病理性疼痛模型，采用免疫电镜、免疫荧光、膜片钳、细胞钙成像、基因敲除等技术手段，阐释下列问题：①豆腐果苷对GABA自分泌及其受体的作用与机制；②豆腐果苷对TRPV1的去敏化作用与机制；③以GABA浓度/GB1-TRPV1活性/GB1-TRPV1表达和共定位∕疼痛阈值改变，结合豆腐果苷药动学参数构建药动-药效模型，确证其抗神经病理疼痛作用机制。本研究可为同属民族药相关药效机制研究提供借鉴。

Sustained TRPV1 sensitization by Inflammation and injury hinder therapy of neuropathic pain. Helicid, a national drug derived from Yunnan folk common used Helicia Lour, relieve neuropathic pain significantly, however, its targets and mechanism is not yet clear. On the basis of previous studies, the applicant inferred that Helicid attenuate inflammatory factors and damage sustained sensitization by a newly discovered of negative feedback regulation: "GABA mediated by TRPV1 to sensitize" in peripheral sensory nerves, blocking "pain→inflammation→sustained pain" cycle, and relieve neuropathic pain. The project intends to establish in vitro and in vivo neuropathic pain models respectively, applying immune electron microscopy, immunofluorescence, patch clamp, cell calcium imaging, and gene knock-out/knock-in technology, explore following questions: ① The action and mechanism of Helicid on GABA autocrine and its receptor ; ②The action and mechanism of Helicid on TRPV1 desensitization; ③ To combine pharmacokinetic parameters of Helicid with GABA concentration /GB1-TRPV1 activity /GB1-TRPV1 expression and co localization / pain threshold changes, and establish an efficacy pharmacokinetic model, confirm the mechanism of helicid relieving nerve pathological pain. This study can provide a reference for related mechanism research of national medicine.

本项目针对上述科学问题，同时基于本课题组的前期研究基础，在2017年为期1年的研究周期中分别从体外研究，细胞模型，及动物模型等层次考察豆腐果苷抗神经病理性疼痛的药效学及药动学特征，并分析其内在机制与近年来引起关注的GABA-TRPV1去敏化过程的关系。主要内容分为下列六个部分：（1）Pallas软件辅助预测结合HPLC-ESI-MS与HPLC-ESI-TOF-MS分析技术鉴定豆腐果苷体内代谢产物；（2）建立并验证了一种用于进行豆腐果苷及其主要Ⅰ相代谢产物的定量研究的UFLC-ESI-MS / MS分析方法；豆腐果苷及其代谢产物在单剂量与多剂量给药情况下药代动力学的比较研究；（3）成功构建神经病理性疼痛模型——坐骨神经慢性压迫性神经痛（Chronic Constriction Injury of the sciaticnerve，CCI），并开展基于病理模型的药效学研究；（4）豆腐果苷在正常与CCI模型大鼠体内的组织分布对比研究；（5）建立了GABA代谢酶活性的体外研究方法，分析豆腐果苷的代谢酶抑制活性；（6）构建了GABAB1及GABAB2的表达EGFP质粒；同时已获得TRPV1质粒。通过在HEK-293细胞共转染，并分析豆腐果苷及其代谢产物对GABA介导的TRPV1去敏化作用分子机制。通过上述研究，我们分析鉴定出11种代谢产物；发现在单剂量与多剂量状态下，在病理状态下豆腐果苷的体内代谢行为均发生显著改变，此种差异与其药效作用可能相关；同时对豆腐果苷及其代谢产物调控GABA-TRPV1信号的机制进行了初步探讨，我们的工作也厘清了既往及同类研究中存在的不足和问题。