海水养殖环境存在多种病原，危害我国海水养殖鱼类发展。疫苗免疫是预防养殖鱼类疾病的重要手段，现有的单联和单价疫苗难以防治多种疾病，研制多联和多价疫苗是一个预防疾病的有效途径。申请人在前期工作中构建和筛选了多株迟缓爱德华氏菌弱毒疫苗，建立了以迟缓爱德华氏菌弱毒疫苗为基础表达和分泌异源抗原的载体疫苗。本项申请拟进一步构建和筛选能够表达和分泌不同病原抗原的迟缓爱德华氏菌载体疫苗，评价载体疫苗在鱼体分泌和呈递异源抗原的能力，分析载体疫苗诱导的免疫应答和免疫保护，阐明载体疫苗的抗原呈递和免疫保护机制，为研制鱼用多价疫苗提供应用基础理论。

Varieties of pathogens in marine environment endanger aquaculture in China. Vaccine is an important means to prevent diseases in farmed fish. Multivalent and polyvalent vaccines could be an effective way to control a variety of diseases rather than univalent vaccine. In previous work, we constructed and screened many strains of attenuated Edwardsiella tarda vaccine, and established E. tarda attenuated vaccine carrier to deliver heterologous antigen. This study aims to screen E. tarda vaccine as a carrier to deliver other pathogens antigen in fish. We will detect heterologous antigen expression and presentation by vaccine carrier in fish, and analyze vaccine-induced immune response and protection. The present study will clarify antigen presentation and immune protection mechanism of vaccine carrier, and provide valuable data to develop polyvalent vaccine in fish.

迟缓爱德华氏菌是水产养殖动物的重要病原菌，本研究以迟缓爱德华氏菌弱毒疫苗作为载体，通过无抗性的平衡致死质粒表达外源蛋白，利用细菌的III型分泌系统（T3SS）信号肽，以T3SS作为抗原呈递途径，构建了迟缓爱德华氏菌弱毒载体疫苗，并通过动物实验检测载体疫苗对抗原的呈递和免疫保护作用，具体研究内容简述如下：首先，本研究在迟缓爱德华氏菌asd（天冬氨酸-β-半乳糖脱氢酶）基因缺失突变株的基础上，构建了3株不影响迟缓爱德华氏菌T3SS表达的多基因缺失突变株，并转入含有asd基因的pYA3342平衡致死质粒构建了3株平衡致死弱毒疫苗载体，利用蓝蔓龙作为实验动物，筛选到了毒性最低、免疫保护效果最佳的弱毒疫苗载体LSE40ΔasdΔrpoSΔpurA-pYA3342。其次，本研究将T3SS效应蛋白EseG的转运信号肽与外源抗原蛋白基因进行熔合，并插入pYA3342质粒中，转化入筛选到的菌株中，构建了3株迟缓爱德华氏菌弱毒载体疫苗LSE40ΔasdΔrpoSΔpurA-pYA3342-OmpU/FlaB/GapA34。载体疫苗通过注射和浸泡的方式感染大菱鲆，对鱼体组织内弱毒疫苗的数量和外源抗原的表达情况进行了检测。最后，本研究通过腹腔注射的方式对大菱鲆进行免疫，检测了免疫后鱼体血清对迟缓爱德华氏菌、鳗弧菌和嗜水气单胞菌的抗体效价，并在免疫1个月后进行注射攻毒，检测弱毒载体疫苗的免疫保护作用。3株弱毒疫苗载体对迟缓爱德华氏菌的免疫保护率均高于60%，表达相应病原菌抗原的载体疫苗在免疫大菱鲆后，对鳗弧菌、嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌的免疫保护率在均高于40%。综上所述，本研究构建了迟缓爱德华氏菌的弱毒疫苗载体，分析了载体疫苗诱导的免疫应答和免疫保护，为研制渔用多价疫苗提供应用基础理论。