肌浆网(SR)是细胞内贮存钙离子的关键细胞器，它与细胞膜(PM)连接形成调控细胞内钙的重要通道。蛋白-蛋白复合物是实现SR-PM连接的基础，明确SR-PM连接机制并寻找新的复合物是目前研究的热点。缺血-再灌注损伤(IRI)诱导的血管功能紊乱多伴有细胞内钙超载，前期研究发现迷走神经刺激(VNS)可改善IRI血管收缩功能紊乱，但对SR-PM连接介导的细胞内钙的影响尚未见报道。本课题拟采用转基因动物或siRNA细胞建立IRI模型；应用激光共聚焦和荧光共振能量转移等技术检测细胞内钙和SR-PM连接复合物的耦合作用；应用微血管张力测定技术检测血管功能；应用分子生物学和免疫组化等技术检测SR-PM连接蛋白及下游收缩相关蛋白的表达及活性。探讨IRI对血管平滑肌SR-PM连接和钙超载的影响，阐明迷走神经对血管平滑肌细胞SR-PM连接的调控作用及改善血管收缩功能紊乱的分子机制，为心血管疾病的防治提供新靶点。

Sarcoplasmic reticulum (SR) is a pivotal intracellular calcium store, which forms an important junction with the plasma membrane (PM) to regulate calcium flow. Protein - protein complexes are the basis to activate SR-PM junctions, therefore current research mainly focus on the mechanism of SR-PM junctions and exploring new complexes. Ischemia - reperfusion injury (IRI) induced vascular dysfunction, which is often accompanied with calcium overloading. Our studies have found that vagal nerve stimulation (VNS) can improve the IRI vasomotor dysfunction. Nevertheless, the effect of VNS on SR-PM junctions and calcium overloading in IRI vasculature has not been demonstrated. This research adopts the transgenic animal or siRNA-treated cells to mimic IRI. The confocal laser scanning microscope and fluorescence resonance energy transfer technique are performed to evaluate calcium concentration and SR-PM junctions; microvascular wire myograph system is performed to evaluate isometric tension of isolated artery rings; molecular biology and immunohistochemistry techniques are used to detect expression and activity of the related proteins. The mechanism of IRI-induced SR-PM junctions and calcium overloading, and the possible protective effect of VNS on vascular dysfunction induced by IRI model will be clarified. These findings will be hopeful to provide new targets on the prevention and treatment of cardiovascular disease.

心血管疾病是危害人类健康的首要疾病。已有研究表明心肌缺血/再灌注可诱发炎症，进而加重细胞钙超载，诱导组织器官的进一步损伤。活化迷走神经可激活胆碱能抗炎通路改善心脏和血管功能，但其递质--乙酰胆碱（Acetylcholine，ACh）抑制钙超载的分子机制尚不清楚。本研究采用siRNA基因沉默技术、肌张力描记技术、激光共聚焦和免疫共沉淀等技术，从组织和细胞两个水平阐明ACh对细胞内钙离子调控的分子机制。研究发现1）缺氧/复氧（Hypoxia/reoxygenation，H/R）可显著性增加大鼠肠系膜动脉血管钙敏感性受体（Calcium sensing receptor，CaSR）表达，诱导血管收缩功能和内皮依赖性舒张功能异常。外源性给予ACh不仅可以显著性改善H/R诱导的血管环收缩/舒张功能异常，也可以抑制由CaSR激动剂R568介导的动脉血管对钙的反应性增加。表明ACh通过抑制H/R诱导的CaSR过表达发挥血管功能的保护作用；2）内质网(Endoplasmic reticulum，ER)是细胞内贮存钙离子的关键细胞器，可与细胞膜(plasma membrane，PM)发生交互，以蛋白-蛋白复合物的形式调控细胞内钙离子的流动。TNF-α可显著性增加内皮细胞ER-PM的交互作用及NCX1-TRPC3-IP3R1复合物的形成，且新复合物参与了NCX1介导的细胞外钙内流和IP3R1介导的内质网钙离子释放。ACh能够明显降低TNF-α诱导的NCX1-TRPC3-IP3R1复合物形成、改善细胞内钙紊乱。然而降低M3AChR或AMPK表达均可抑制ACh对内皮细胞的保护作用。表明ACh通过上调M3ACh/AMPK通路抑制NCX1-TRPC3-IP3R1复合物的形成，降低TNF-α诱导的内皮细胞钙紊乱和凋亡；3）细胞内钙离子浓度升高可以激活钙蛋白酶（calpain）使部分心肌收缩蛋白降解，诱导心肌细胞凋亡，结果显示TNF-α可通过活化p38显著性增加H9c2心肌细胞calpain活性和蛋白表达。ACh可显著性低心肌细胞中calpain活性及p38磷酸化，M2 AChR siRNA可部分废除ACh对calpain和p38的抑制作用和抗凋亡作用。表明，ACh通过M2AChR降低p38/calpain 发挥抗凋亡作用。综上所述，ACh对心血管的保护作用与钙离子调节相关。