神经缺损的修复到目前仍是世界难题，各国学者试用了多种方法、材料，虽取得很大成就，但仍难以突破现实临床应用的瓶颈，去细胞神经（ANS）是目前公认的可与自体神经相媲美的移植材料，但对自身成分在修复过程的分子机制研究甚少， Fibronectin、Laminin是主要成分，可促进细胞黏附、迁移和轴突的生长，课题组结合前期ANS研究，运用分子克隆的方法，获取Fibronectin、Laminin的cDNA，经基因转染，过量表达处理ANS，修复神经缺损，评判修复效果；分析脊髓组织中GDNF、VEGF等改变；观察神经元的变化；利用Western-blotting、蛋白质谱分析检验移植物内标志蛋白的表达差异，筛选出表达差异最大的蛋白，通过免疫共沉淀，验证Fibronectin、Laminin与其相互作用，探讨Fibronectin、Laminin在神经再生过程的分子机制，为提高ANS的利用提供科学依据。

•.Nerve regeneration so far remains a challenge all of the world, although scholars and professionals in many countries try a variety of methods, materials, and made great achievements, it is still difficult to break through the bottleneck of clinical application . As we all known ANS as a graft material is comparable with autogenous nerve, while the molecular mechanism research of its ingredient is studied little in the recovery process. Fibronectin and Laminin are the main ingredients, which can promote cell adhesion, migration, and the growth of axons. Our team combined early ANS research, using the method of molecular cloning to obtain the cDNA of Fibronectin and Laminin, and repair the peripheral nerve and evaluate the efficacy by transfecting gene and overexpressing dealing with ANS. Besides we analyzed the variation of GDNF、VEGF in Spinal cord , observed the changing of neuron and inspect the expression differences of the graft marker protein by Western-blotting and proteome analysis to screen out the protein which express biggest difference. Finally we use immune coprecipitation to validate interaction between the protein and Fibronectin, Laminin . By all above we aim to explore the molecular mechanism of Fibronectin, Laminin in nerve regeneration process, and to provide scientific basis for improving the use of ANS.

研究背景：ANS的主要成分是 Fibronectin、Laminin，可促进神经细胞黏附、迁移和轴突的生长，目前对这两种蛋白的研究主要是通过体外细胞培养、施加外源性FN、LN或在体内移植物中施加FN、LN，但对FN、LN在修复过程中的分子机制研究甚少。主要研究内容：通过阐明Fibronectin、Laminin两种蛋白在促进神经修复再生的作用和机制，从而改变Fibronectin、Laminin的成分，获得更好的修复效果。将鼠坐骨神经内FN和LN两个蛋白的基因cDNA的获取、基因扩增，并构建FN、LN质粒载体。取羊胫神经制备去细胞神经支架备用。取兔100只，随机分为5组，手术切断坐骨神经造成缺损，依次利用对应成分修复神经缺损。术后，于4w、8w，12w对实验动物行神经修复物取材，利用Western-blotting、蛋白质谱分析检验移植物内标志蛋白进行定性定量分析，筛选出表达差异最大的蛋白，通过免疫共沉淀，验证Fibronectin、Laminin cDNA基因能否促进蛋白的合成，进而使细胞粘着、细胞移动、细胞增殖、细胞分化以及神经突起的伸展。对实验动物一般情况观察:手术切口的愈合状况，患肢足部针刺觉，足趾运动情况，患侧肌肉萎缩等，于术后4w、8w，12w对实验动物行电生理学检测，对修复神经段取材行组织学观察和小腿肌纤维横径检测，评定神经功能恢复情况。比较不同分组之间的神经损伤再生修复效果水平。并行免疫共沉淀检测修复段内FN、LN与S-100蛋白相互作用。重要结果及关键数据：1.采用双酶切鉴定FN和S100重组质粒示：FN双酶切，切出5000bp和300bp条带，而S100切出5000bp和400bp条带。FN和S-100切出条带大小符合理论预期。初步鉴定FN和S100构建成功。2.采用IHC检测吻合断端的LN和FN，光镜下显示基底膜呈黄色、棕黄色的LN和FN阳性反应，证明经过吻合手术处理后LN和FN的成分大部分生成，且与正常坐骨神经比较，其阳性较强，说明在手术治疗的过程中部分细胞外基质成分出现显著改变。科学意义：A组的神经再生效果明显优于其他三组。Fibronectin、Laminin cDNA基因能够促进内环境细胞大量合成FN、LN。Fibronectin Laminin两种蛋白的表达，可以更好促进受损神经的再生修复，这为临床神经损伤修复提供更为有效