耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是院内外感染的重要病原菌，呈多重耐药。对β-内酰胺类的特殊耐药机制为表达耐药蛋白PBP2a和稳定的自溶酶系统以继续维持细胞壁的合成。本项目前期以抗菌增敏活性为导向，从山楂中分离到儿茶素类化合物CE，CE共同作用具有显著的体内、外抗菌增敏活性。其作用机制与β-内酰胺酶和PBP2a无关，与影响细菌自溶酶系统的基因sarA有关。本项目以标准株WHO-2为研究对象，首先研究CE对sarA及其调控网络中各基因的影响，明确及筛选变化最明显的基因；其次封闭sarA，研究CE的抗菌增敏作用及自溶酶系统功能学的变化；再次，封闭sarA调控网络中变化最明显的基因，再次观察CE的抗菌增敏作用及自溶酶系统功能学的变化，从而明确CE的抗菌增敏作用机制和作用靶点，为MRSA抗菌增敏剂的研发提供新的靶点及研究思路。

Meticillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is one of the principal multiply resistant pathogenic bacteria that causes serious healthcare-associated and community-onset infections, and is resistant to all kinds of antibiotics especially of beta-lactams. The resistance mechanism of MRSA to β-lactam antibiotics involves the penicillin-binding protein-PBP2a and stable autolysis system in order to maintain the synthesis of cell wall. Previously, we succeeded to isolate catechin compounds CE from hawthorn depending on the antibacterial sensitizating activity. CE showed obvious antibacterial sensitizating activity in vitro and in vivo. There is no connection between the mechanism of this activity and β-lactamase and PBP2a, but it may affect bacteria autolysis enzyme system and decrease sarA gene mRNA expression. To examine the mechanism of the CE`s antibacterial sensitizating activity, we plan our research as follows: ①study the influence of CE to sarA and genes in its regulatory systems in order to identify and screen which is the most ovbious change. ②Knocking down sarA mRNA expression with antisense oligonucleotide technology, study the influence of CE on Antibacterial sensitization activity and the change of autolysis systems. ③ Knocking down the gene mRNA expression with antisense oligonucleotide technology which is selected from the first step, study the influence of CE on Antibacterial sensitization activity and the change of autolysis systems again. In order to identify the mechanism and target of CE.

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin - resistant staphylococcus aureus，MRSA）是临床和社区常见的耐药菌，治疗棘手，死亡率高。MRSA对β-内酰胺类的耐药机制为表达耐药蛋白PBP2a和稳定的自溶酶系统以继续维持细胞壁的合成。前期以抗菌增敏活性为导向，从山楂中分离到儿茶素类化合物CE具有显著的体内、外抗菌增敏活性。其作用机制与抑制β-内酰胺酶的活性和与PBP2a无关，与影响细菌自溶酶系统有关。本项目以WHO-2为研究对象，首先确认CE对MRSA WHO-2自溶酶系统的影响，①CE对WHO-2自溶速率的影响，结果为C对Triton X-100诱导的WHO-2自溶速率没有影响；ECg可以呈浓度依赖的抑制Triton X-100诱导的WHO-2自溶速率。而CE呈浓度依赖的抑制Triton X-100诱导的WHO-2自溶速率。②CE对自溶酶谱表达变化的影响，结果为C对WHO-2自溶酶的表达无明显影响，ECg可呈浓度依赖的抑制WHO-2主要自溶酶的表达；CE联合OXA后能进一步抑制自溶酶的表达。③利用RT-PCR技术明确自溶酶系统中各基因高表达量的时间点，结果显示各基因在药物处理6h时有表达呈高峰。第二，因WHO-2的sarA敲除进行不顺利，利用sarA敲除菌SA75-△sarA，研究CE对SA75-△sarA的抗菌增敏作用及自溶酶系统的影响，结果为CE对SA75具有抗菌增敏作用，对SA75-△sarA没有抗菌增敏作用，观察CE对上述两株细菌的自溶速率的影响，结果为CE可以抑制TritonX-100诱导的SA75的自溶速率，而对SA75-△sarA没有影响，初步明确sarA为关键作用靶点。第四，利用PCR-array技术和qPCR技术，筛选WHO-2表达谱中与自溶酶系统相关的100个基因，验证其中变化最明显的20个基因，结果显示，CE可以显著抑制WHO-2自溶酶系统相关基因表达谱中PrsA基因的表达，PrsA为100个相关基因中变化最为明显的基因。第五，利用生物信息学技术，分析CE对PrsA的结合情况及结合位点，结果显示，CE可结合在PrsA蛋白功能区，氨基酸序列为134-224，主要结合位点为LEU-163，ASP-162，GLU-220。大部分完成实验工作，后续实验仍在进行，前期实验结果待发表SCI文章1篇，投稿过程中。