肿瘤坏死因子（TNF）是一类参与免疫调节等生物过程的细胞因子。目前对贝类TNF的基本组成、进化与功能缺乏系统的认识。本项目前期从长牡蛎基因组中鉴定出了23个TNF基因，进化分析表明TNF基因的发生了牡蛎特异性的扩张，对重复基因分化规律的研究也提示着TNF家族可能在牡蛎环境适应过程中发挥作用。为了阐释长牡蛎TNF家族的进化规律及其在免疫防御中的作用，在前期研究基础上，本项目将利用生物信息学及分子生物学手段，重点从进化、表达和功能三个角度对长牡蛎中TNF家族展开系统研究。首先在基因组水平上理清长牡蛎TNF基因的进化模式，然后在转录组水平上揭示长牡蛎TNF基因的表达模式，最后选定一些TNF进行分子水平的验证，并通过高温胁迫与病害刺激实验初步分析TNF分子在免疫防御中的功能。本项目将为全面揭示TNF在长牡蛎环境病害防御过程中的功能奠定基础，对于贝类TNF的基础研究和实际应用都具有重要意义。

Tumor necrosis factors (TNFs) represent a group of cytokines participating diverse biological pathways, such as immunoregulation. Due to the lack of systematic investigation, little is known about the composition, evolution and functions of TNFs in Mollusks. Our primarily analysis identified 23 TNF genes in the genome of Pacific oyster (Crassostrea gigas), and the evolutionary analysis indicated that the TNF genes were underwent oyster-specific expansion. Furthermore, our study on the diversification of duplicated genes suggests TNF family may play important roles in the adaption of oysters to harsh environment. In this proposal, by extending our initial results, we plan to investigate evolutionary patterns and immune defense functions of TNF family in Pacific oyster. By using the combined methods from bioinformatics and molecular biology, we will concentrate on systematic investigations of the evolution, expression and function of TNF family in Pacific oyster. The goals of this proposal are: 1) to clarify the evolutionary patterns of oyster TNF genes under genomic lever, 2) to profile the gene expression patterns of oyster TNF genes under transcriptomic lever, and 3) to validate the selected TNF genes under molecular level and to achieve the immune defense functions of specific TNFs through controlled experiments of high temperature stress and pathogen stimulation. This proposal will lay a solid foundation for thoroughly deciphering the functions of oyster TNFs during the process of environmental and pathogen prevention, and also it will provide important insights for both basal and applied researches of molluscan TNFs.

作为参与免疫调节等生物过程的细胞因子，肿瘤坏死因子（TNF）被广泛研究，《Nature》杂志2017年选出了10个研究最多的基因，TNF位列第二。然而，与后口动物和刺细胞动物相比，原口动物可用于比较基因组分析的资源较少，对这一大类群中TNF家族整体组成和进化的认识也相对不足。本项目利用生物信息学及分子生物学手段，从进化、表达和功能三个角度对长牡蛎中TNF家族展开系统研究。通过全面分析软体动物基因组、转录组数据及已发表文献，鉴定得到81个TNF基因。其中长牡蛎中有23个TNF成员，构成了与脊椎动物类似的TNF超家族。系统发育分析表明长牡蛎中有13个TNF 基因与马氏珠母贝中的TNF基因存在保守的直系同源关系，同时也鉴定出了5个支系包含了15基因属于长牡蛎特异性的支系，说明了TNF成员经历了快速的物种特异性扩张。基因组共线性分析表明牡蛎特异性的TNF基因是由复杂的串联重复和片段重复机制产生的。通过比较代表性重复基因对的外显子-内含子结构变化和蛋白结构域的组成，发现了外显子丢失、内含子长度变异等不同的结构分化机制，表明长牡蛎中部分重复产生的TNF基因发生了结构分化。分子进化分析进一步说明了重复的TNF基因大多经历了纯化选择的作用。通过分析牡蛎转录组数据，获得了19个TNF基因在组织、生长发育阶段和胁迫过程（温度、盐度和干露胁迫）中的基因表达模式。进一步通过对重复基因对的表达相关性的分析，表明大部分重复基因具有相关的表达模式，从而印证了纯化选择的作用。根据进化机制分析结果，选择了具有不同进化模式的4个长牡蛎TNF基因进行分子生物学研究。通过实验分析研究了这些TNF基因的序列组成和在免疫防御过程中的基因表达，结果表明高度保守的TNF基因的表达模式较为一致，而相对保守TNF基因则发生了一定程度的表达分化。本项目阐释了长牡蛎TNF家族的进化规律及其在免疫防御中的作用，对于全面理解贝类TNF基因的分子功能和未来应用具有重要意义。