前期工作发现：miR181b及其上游调控因子STAT3在视网膜母细胞瘤（Rb）中高表达；miR181b负调控下游因子NLK功能。结合文献分析，我们设想Rb生长转移受STAT3-miR181-NLK-Wnt/β-catenin信号通路调控：STAT3上调miR-181表达后， NLK表达受到抑制，导致Wnt/β-catenin信号通路激活，从而促进Rb生长和转移。本项目将通过体内外实验对此进行验证：1、检测STAT3、miR-181、NLK和Wnt/β-catenin在Rb组织和细胞中表达；2、鉴定STAT3、 miR-181和NLK是否存在纵向调控关系；3、明确STAT3-miR-181-NLK轴是否调控Wnt/β-catenin功能；4、观察重建或阻断STAT3-miR-181-NLK-Wnt/β-catenin通路对Rb生长转移的影响。本项目有助于深入理解Rb生长转移的分子调控机制。

Preliminary study found that miR181b and its upstream regulatory factor STAT3 is highly expressed in retinoblastoma (Rb) and miR181b has negative regulation on downstream effector NLK. Based on literature review and preliminary work, we propose that Rb growth and metastasis is regulated by STAT3-miR-181-NLK-Wnt/β-catenin signaling pathway: STAT3 raises the expression of miR-181, then NLK expression is inhibited, resulting in activation of Wnt/β-catenin signal pathway, thereby promoting Rb growth and metastasis. The project will validate this through in vitro and in vivo experiments: detection of STAT3, miR-181, NLK and the Wnt/β-catenin expression both in Rb tissues and cells; whether STAT3-miR-181-NLK axis exists or not; whether Wnt/β-catenin signaling pathway is regulated by STAT3-miR181-NLK axis or not; investigation of functional significance of blocking or recovering STAT3-miR-181-NLK-Wnt/β-catenin signaling pathway on Rb growth and metastasis.This project will help us to have in-depth understanding of molecular mechanism regulating growth and metastasis of Rb.

视网膜母细胞瘤 (retinoblastoma, Rb) 是儿童最常见的原发性眼内恶性肿瘤。Rb 可导致患儿失明、眼球丧失甚至死亡，严重威胁患儿身心健康。已完成的研究表明，微小 RNA181b（micro181b, miR-181b）以及其上游的STAT3分子在Rb 中表达异常升高，是促进 Rb 生长的重要因素。但对于 miR-181b 促进 Rb 生长的分子调控机制，目前尚不清晰，亦未见报道。本研究目的：探究微小RNA181b通过miR-181-NLK-Wnt/β-catenin信号通路影响网膜母细胞瘤（retinoblastoma，Rb）生长的作用机制。方法：在Rb细胞系HOX-RB44、Y79中检测NLK和miR-181b表达情况。通过转染干扰、过表达慢病毒探究miR-181b对视网膜母细胞瘤增值的影响。生物信息学预测miR-181b在NLK mRNA上调控位点。通过荧光素酶报告实验验证其与NLK mRNA 3’UTR结合发挥负性调控作用。通过Real-Time PCR和western blot验证miR-181b对NLK以及NLK 对下游Wnt/β-catenin 信号的调控作用。结果：miR-181b在HOX-RB44、Y79中显著高表达，干扰miR-181b能显著抑制肿瘤细胞的增值而过表达miR-181b能显著促进肿瘤细胞的增值。NLK是miR-181b的直接靶点。NLK高表达能抑制Wnt/β-catenin信号通路下游基因β-catenin、cyclinD1、c-myc表达。结论：在视网膜母细胞瘤中miR-181b通过直接靶向抑制NLK发挥对Wnt/β-catenin信号通路的调节作用从而影响肿瘤细胞的生长。综上，本研究表明miR-181b是视网膜母细胞瘤中的促癌miRNA，它促进Rb生长的作用至少部分是通过抑制NLK基因，进而激活Wnt/β-catenin信号通路实现的。这一机制的阐明使得我们对Rb这一儿童最常见原发性眼内恶性肿瘤发生发展的分子机制有了更深入的理解，并为视网膜母细胞瘤化学治疗和靶向分子治疗提供了潜在靶点和实验依据。