近年来CRAC通道为新型免疫抑制剂开发的热点，其组成蛋白ORAI1为抑制剂开发的关键靶蛋白。前期工作中，我们高通量筛选得到一个该通道抑制剂Old3_4，对其进行化学结构改造，意外得到一个该通道开放增强剂ZHZ090。前期实验结果提示Old3_4和ZHZ090的靶蛋白是ORAI1，本项目首先将进一步确认ORAI1为靶蛋白，然后拟采用多种策略来分析Old3_4和ZHZ090在靶蛋白上的作用位点和作用机理：1）突变人ORAI1找作用位点；2）根据果蝇ORAI结构，利用同源建模模拟人ORAI1结构，预测作用位点和机理，突变后实验确认；3）表达纯化ORAI1蛋白，与Old3_4和ZHZ090共长晶体，利用晶体衍射数据，分析化合物作用位点和机理。对ORAI1上重要功能位点的发现和确认，对调节CRAC通道开关的新型活性物质作用机理的研究，将会为CRAC通道的基础研究和未来的药物设计提供重要信息。

Recently CRAC channel has become the hot target for the development of the new immune suppressor.ORAI1,the pore-forming subunit of this channel, is the key target protein. In our forming work, we obtained a CRAC channel inhibitor,named Old3_4 by high throughput screening. To our surprise, we got one CRAC channel open enhancer, named ZHZ090 by chemical structure modification of Old3_4. Our data suggested that both of these two compounds targeted to ORAI1. In this subject, firstly we will further confirm that ORAI1 is the target protein of these two compounds, then we will adopt the following strategies to identify the target site, and to investigate the action mechanism of these two compounds: 1) mutating all the possible sites on ORAI1 and testing the action of thes two compounds; 2)based on the known structure of drosophila ORAI protein，homology modelling the structure of human ORAI1 and predicting the possible target site and the action mechanism of these two compounds, then confirming the prediction by experiment; 3)growing crystal with expressed and purified ORAI1 protein and these two compounds, then identifying the target site and exploring the mechanism of action. The identification of the important funcional site of ORAI1 protein and investigation of the action mechainism of the new CRAC channel open enhancer and inhibitor, will provide important information for the CRAC channel basic research and for the future design and development of new specific immune suppressor.

近年来CRAC通道为新型免疫调节剂开发的热点，其组成蛋白ORAI1为调节剂开发的关键靶蛋白。在本基金的资助下，我们采取了细胞生物学、分子生物学、合成化学和生物物理等多学科交叉的方法，研究了前期筛选得到的新型小分子抑制剂Old3_4的特异性和构效关系；化合物2-APB在CRAC通道上产生增强电流的机理；以及这两种化合物在CRAC通道上可能的作用靶点。我们的结果表明：1）Old3_4的抑制活性，通过靶向于人ORAI1以及果蝇ORAI，而不是靶向于人STIM1、ORAI2和ORAI3。通过化学合成，我们明确了Old3_4的构效关系：脲结构旁侧苄胺上的烷基替代，对于该化合物的抑制活性是必须的，替代的烷基S构象优于R构象。2）我们测量了通道孔径，发现2-APB将通道孔径从3.8埃拉大到4.6埃。小离子，如钙和钠，在孔径狭窄、野生型的CRAC通道上面有着明显的2-APB引起的增强电流；但是在孔径变大的、突变的Orai1-V102C/A/G通道上，增强电流下降或者消失。相反，大的铯离子，可以阻塞野生型的CRAC通道，但是在孔径变大的Orai1-V102C/A/G通道上，有变大的增强电流，电流增强的比例在有着中等孔径的Orai1-V102C通道上面最大。这些数据表明2-APB产生增强电流的原因是拉大了ORAI1通道的孔径，通道孔径大小和离子大小同时决定增强电流的大小，该作用不依赖于STIM1。我们正在采用单颗粒冷冻电镜技术，解析ORAI蛋白和Old3_4或2-APB衍生物复合物的结构，目前2-APB衍生物和ORAI蛋白复合物的结构分辨率已经达到7.6埃。我们研究靶向于ORAI1的小分子Old3_4和2-APB的作用方式、机理和靶位点，将会为CRAC通道的基础研究和未来的药物设计提供重要信息。