通过在一个PCR反应体系里提供两对或两对以上引物、能够同时扩增出多个核酸片段的PCR技术称为多重PCR技术。由于多重PCR既具有常规PCR的敏感性和稳定性，又具有一定的通量能力，因此被广泛应用于科研、临床诊断等领域。然而，受体系中的引物二聚体、非特异扩增、不均一的起始模板浓度等的影响，建立稳定的多重PCR扩增体系异常困难。目前常用方法是通过大量的实验不断试错来优化多重PCR反应体系，不但耗时、耗力，而且难以保证成功率。为此，本课题提出建立多重PCR体系的计算机仿真系统，即1) 预测反应中存在的各种状态，如发卡结构、引物与模板的不完全匹配、非特异扩增等；2）建立多重PCR的多状态偶联平衡模型，构建多状态方程；3）依据仿真系统，在定量水平动态地模拟多重PCR的扩增状态，从而实现在理论上对多重PCR体系的优化并进行实验验证，最终提高多重PCR实验的成功率，对于提高临床分子诊断效率具有重要价值。

Multiplex polymerase chain reaction (PCR), defined as the simultaneous amplification of multiple regions of a DNA template or multiple DNA templates through the use of multiple primer sets in one tube. Due to its sensitivity, reliability and medium throughput, multiplex PCR has been widely used in science research and clinical diagnostic applications. However, because of the dimers, non-specific amplicons and different templates concentrations, it's difficult to construct an effective multiplex PCR reaction. And it's time consuming and costly by repeated experimental optimizing process. Therefore, we are starting a new project called "Computer simulation of multiplex PCR". In details, 1) predicting the primer states in the reaction, such as hairpins of primers, non-specific bindings between primers and its target DNAs. 2) constructing the multiple-state coupled equilibrium to stimulate the multiplex PCR reaction, and 3) use this computer simulation system to simulate the multiplex PCR reaction dynamically and quantitatively. As a result, we can optimize the multiplex PCR reaction conditions before the real experiments, and finally improve the success rate of multiplex PCR.

由于多重PCR体系中存在多条引物，因而极易发生引物二聚体、非特异扩增等现象，影响实验体系稳定甚至造成实验失败。本课题提出并建立了多重PCR体系的计算机仿真系统，通过理论上的优化设计最大化提高多重PCR的成功率。1）开发了PCR引物质量分析软件MFEprimer 3.0版本，对体系中的引物进行二聚体、发卡结构、非特异扩增等非正常结构状态进行预测，重点引入了第三方DNA介导的二聚体分析和SNP位点分析功能。2）为了解决利用序列比对软件进行引物结合位点分析时可能存在遗漏等问题，提出并开发了完全基于热力学的全基因组寡核苷酸结合位点分析软件ThermoMatch 1.0版本，使得对引物的结合位点预测分析更为精确；3）根据多状态偶联平衡模型，构建了多状态方程，编写了多重PCR体系仿真系统SimuPCR（版本1.0），并模拟了引物解链温度（Tm）一致、引物退火温度（Ta）一致以及非特异扩增对PCR平衡方程的影响。根据模拟实验结果得到两条重要的结论：第一，引物设计需要保证在退火温度下各个引物的扩增效率一致，即引物△G一致，而不是Tm一致。这一结论，与多数研究者多年来的经典引物设计观点（保证Tm一致）相左，待进一步实验确证后，将改变现有的经典PCR引物设计理论并将极大提高PCR反应的成功率。第二，引物的非特异结合除了导致非特异扩增产物外，更重要的是它降低了引物原有的扩增效率，导致了引物扩增的不平衡，这在体系复杂的多重PCR反应中，极有可能导致扩增失败。本课题在建立多重PCR体系的仿真系统过程中，将理论实用化为软件系统，开发了具有独立功能，但又相互补充的三个软件（MFEprimer 3.0，ThermoMatch 1.0，SimuPCR 1.0），不仅可以帮助研究者进行引物质量分析，还可以利用多重PCR体系的仿真系统进行模拟实验，通过模拟实验，一方面可以发现引物质量问题（如非特异扩增），提高实验成功率；另外一个方面，还可以发现一些用现有理论无法解释的实验难题（如Tm一致引物扩增效率却差别很大）。总之，多重PCR体系仿真系统的建立，将在理论和实验方面推动多重PCR较快发展，为多重PCR在科学研究以及临床应用提供更为坚实的基础。