非抗体类抗肿瘤蛋白药物通常因缺乏靶向作用而产生毒副作用，而且肿瘤细胞内吞摄取效率低，其临床应用的瓶颈是缺乏高效的靶向给药技术。配体偶联介导给药是实现抗肿瘤蛋白药物靶向治疗最有前景的给药技术，但是配体-蛋白偶联给药系统的构建存在较大困难，例如定点偶联及多功能靶向配体的制备等。为克服这些问题，本项目提出基于生物点击化学技术进行"模块式"构建具有二级靶向作用的蛋白给药系统的策略：（1）采用基因工程技术将含有点击反应基团的非天然氨基酸定点重组入蛋白药物；（2）基于计算机结构模拟，优选出由两种不同肿瘤归巢肽组合的嵌合序列(含相应的点击反应基团)作为多靶向功能模块（肿瘤血管趋向及肿瘤细胞靶向功能）；（3）基于点击化学，定点偶联构建得到蛋白药物肿瘤靶向给药系统。本项目选取核糖体失活蛋白作为切入点，以非天然氨基酸蛋白重组技术与点击化学结合，合理设计、构建高效靶向给药系统，为蛋白肿瘤靶向给药研究提供新思路。

Anticancer protein drugs (non-mAbs) generally lack targeting delivery efficacy and thus cause toxic side-effects, as well as the poor cell penetration and the consequent unproductive treatment outcomes. Therefore, it is pressing for developing high efficient delivery systems for solving the clinical need. However, Ligand-mediated targeting delivery is one of the most promising techniques for protein therapy. Yet,there are still some major hurdles need to be solved, including site-specific conjugation of proteins and build of multifunctional targeting ligands. We thus propose a bio-click chemistry strategy for developing tumor-targeting protein delivery systems. First, a certain non-natural amino acid containing an active group (e.g. azide) for click reaction will be site-specifically incorporated into the recombinant protein via genetic engineering method. Second, a chimeric tumor-homing sequence with multifunctional targeting motif will be developed based on in-silico screening, aiming at achieving both neovasculature homing and tumor cell-penetrating functions. Benefit of computer-assisted design is that the peptide combination will be easily optimized by analysis of their steric interaction. Last, the targeting block (containing alkyne click-reaction group) will be site-selectively conjugated to the recombinant protein via click reaction. In our proposal the ribisome-inactivating protein (i.e. saporin) will be strategically selected as model drug, and a technique platform merging protein engineering and click chemistry will be developed for improved protein delivery for cancer therapy.

在本项目，我们发展了一个采用内含肽（Intein）介导定点修饰的“大分子前药”的创新思路，构建了具有多级靶向的肿瘤酶响应型天花粉蛋白给药系统。内含肽介导定点偶联可通过基因工程方法将内含肽及纯化标签引入待修饰天花粉蛋白药物的表达质粒中，表达得到天花粉蛋白-内含肽-纯化标签融合蛋白。纯化时采用L-半胱氨酸进行柱上切割，可直接在天花粉蛋白的C端产生一个半胱氨酸，其巯基能够与带马来酰亚胺活性官能团的多肽、蛋白或化合物进行高效的定点偶联。本研究采用了具有主动靶向作用的乳铁蛋白（lactoferrin, LF）来修饰天花粉蛋白毒素分子，LF不但可靶向脑胶质瘤血管内皮细胞表面高表达的低密度脂蛋白受体相关蛋白-1（LRP-1），而且还可屏蔽天花粉蛋白的活性区域，有效地减少蛋白毒素与正常细胞的相互作用，降低毒副反应，令蛋白处于“失活”状态，具有类似于前体药物的给药特征。该给药系统可通过主动靶向到达脑部肿瘤微环境。由于还在天花粉蛋白毒素分子中引入了穿膜肽序列和肿瘤酶底物序列，该底物序列在肿瘤组织微环境中可以被酶切，从而释放出带有穿膜肽序列的蛋白毒素分子，“激活”蛋白毒素的入胞行为，特异性杀死肿瘤细胞。此外，LF修饰还延长天花粉蛋白的半衰期，有利于蛋白毒素通过EPR效应被动靶向于肿瘤部位。本研究采用了内含肽介导的蛋白质连接技术结合了重组基因技术和化学合成技术，将重组蛋白的表达、纯化和修饰一体化，实现了一步反应，既简便又高效，具有工业生产的潜力。此外，采用了多级靶向的“大分子前药”设计，有效地改善的天花粉蛋白半衰期短、肿瘤细胞摄取率低、免疫原性强的缺点，提高了其抗肿瘤应用转化的潜力。