本项目拟构建胍基化的SS-PAAs（含二硫键的聚氨基胺类）聚合物作为基因转运载体，旨在解决非病毒类基因载体所面临的转染效率低/细胞毒性大的问题；基于胍基的良好膜透性和拟肽类核定位效应，以及SS-PAAs固有二硫键的还原敏感性，有望得到新一代高效低毒的基因药物转运载体。针对不同的基因药物治疗策略（cDNA，siRNA，microRNA）制备基因/载体复合物，利用多种检测手段（DLS，TEM，AGE，ELS等）对聚合物及基因/载体复合物的物理化学性质进行综合性评价，考察基因载体的生物学特性（细胞毒性、体外转染效率），探索分析不同载体物理化学性质与载体性能之间的关系；以激光扫描共聚焦显微镜和原子力显微镜为主要方法，以氯喹为干预手段，研究基因载体跨膜转运动态过程，找出影响基因转运和转染效率的关键环节，探讨载体的拟肽类核定位效应。为进一步设计及优化胍基化SS-PAAs基因载体提供更为深入理论依据。

Currently，low transfection efficiency and high cytotoxicity are the main problems of non-viral gene vectors. The governing reason for this phenomenon is that a contradictory relationship exists between transfection efficiency and cytotoxicity. In another word, the most important strategy to increase trancsfection efficiency is improving cell membrane permeability, bub at the same time these methods will lead to cell injury. Our research project intends to build guanidinylated SS-PAAs polymer gene vector based on the inclusive applications and safety of guanidine compounds in medical field. Also, as one kind of organic bases with biological activities, guanidine compounds exhibit much higher cell membrance permeability than amines, guanidinylated polymers have peptidomimetic nuclear localization effect,and SS-PAAs has been provided with reduction sensitivity because of their inherent disulfide bonds. So we expected to get a nonviral gene vector with higher transfection efficiency and lower cytotoxicity than existing non-viral gene vectors.On the other hand,troubles of side chain/terminal group modification in SS-PAAs vectors could be avoided. Various test methods will be implemented for the screening and research of these nonviral gene vectors.Through these methods, we hope to find out the regularity between chemical structures and biological characteristics. Furthermore, a new theory of design and application about guanidinylated SS-PAAs gene vectors for different strategies of gene therapy could be formed.

在基因治疗领域中，非病毒类基因载体特别是阳离子聚合物因其较高的安全性和较易进行化学修饰的性质而越来越受到关注；但是存在着转染效率低、细胞毒性大和基因释放效率低等问题。本项目构建了五种以胍基作为阳性基团、主链中含二硫键的新型生物可降解聚氨基胺类阳离子聚合物（胍基化SS-PAAs），并对其合成、表征方法和生物学性质进行了评价，探索胍基化SS-PAAs类聚合物作为基因载体的可行性。以五种含胍基的小分子单体分别与含二硫键的交联剂CBA通过迈克尔加成反应构建了五种胍基化SS-PAAs。用1H NMR确证了产物结构，GPC测定了产物分子量。利用动态光散射法，原子力显微镜，琼脂糖凝胶电泳实验对胍基化SS-PAAs分别与三种质粒DNA（pEGFP-N3、pFANCF、pLG3-control）形成的复合物粒径、ζ电位、形态、基因抗降解能力、还原敏感性等性质进行了综合评价。结果表明这些聚合物均具备将三种质粒DNA压缩为纳米级（均＜90nm）基因/载体复合物的能力，并保护其不被核酸酶降解；同时被包载的质粒DNA有很好的释放效率。在两种细胞模型（MCF-7，NIH/3T3）上，分别考察基因/载体复合物的转染效率、细胞毒性、入胞机制及核定位情况。结果表明，胍基化SS-PAAs主要通过网格蛋白和小窝蛋白介导的途径入胞；对比于Lipo 2000和PEI，胍基化SS-PAAs的细胞毒性均更低（细胞活性＞50%，对照组细胞活性约为40%），转染效率更高（均＞70%，对照组＜60%），具有可靠的核定位效应；且复合物在细胞核内分布的区域差异和数量差异是影响转染效率的主要因素。本项目首次对胍基化SS-PAAs的基因递送进行了深入研究，拓展了非病毒类基因载体研究范围；研究了二硫键对于降低载体毒性的作用，丰富了还原响应性基因载体的研究基础。对胍基化载体转染机制的研究为载体功能和结构之间相关性判断提供了参考依据，为进一步的结构改造研究和提升转染效率提供了实验数据支持，达到了项目的预期研究目标。