根系发生困难是影响牡丹体外再生体系建立的关键因素，严重制约了其种苗快繁和遗传转化研究工作的开展。中外学者探讨了各种培养方式和培养条件对牡丹不定根发生的影响，均未取得满意的结果。开展牡丹试管苗不定根发生机理研究应是解决上述问题的根本途径，而分离和鉴定与不定根发生相关基因并探讨其调控机制是研究的重要切入点之一。有关牡丹该方面的研究尚未见报道。目前，课题组已从牡丹中分离出与不定根发生相关的PsARRO-1基因。本研究拟在已获得该基因的基础上，通过构建PsARRO-1基因的实时荧光定量PCR技术体系，研究该基因在牡丹不定根发生过程中时空表达模式，初步揭示PsARRO-1基因是否在牡丹不定根发生过程中特异性表达，并通过遗传转化技术和芯片技术对该基因进行功能分析、鉴定，初步明确其基本功能及所参与的调控过程。上述研究将为探寻牡丹试管苗不定根发生分子调控机制、建立高效体外再生体系提供理论和技术支撑。

本研究以牡丹品种‘凤丹’试管苗为供试材料，在筛选出内参基因β-tu1的基础上，利用实时荧光定量PCR技术，研究PsARRO-1基因在牡丹叶、茎、茎基部在试管苗生根过程中的10个时期的时空表达情况。结果表明：（1）内参基因的筛选：从看家基因中选择β-Tubulin(EF608942)、肌动蛋白基因Action、GAPDH 甘油醛-3-磷酸-脱氢酶基因、18SrRNA (U42792)、β-肌动蛋白（β-action），利用Primer 5软件分别设计β-Tu1、β-Tu2、β-Tu3、β-Tu4、Ac1、Ac2、GA1、GA2、18S1、18S2、β-ac1和β-ac2等6对引物，并进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明：引物β-Tu1、β-Tu2的条带清晰，且扩增片段与目的基因相近。说明在牡丹试管苗各部分稳定表达，不受外源和内源因素的影响，且具有与目标基因相似的稳定表达水平，所以确定引物β-Tu1、β-Tu2为内参基因。（2）实时荧光定量PCR体系的确立：采用三步法real-time PCR，退火温度分别设置52℃、54℃、56℃、58℃、60℃5个梯度；循环数分别设置36、38、40、42、44个循环。根据溶解曲线起跳的时间以及扩增效果确定最佳的PCR反应体系为：95℃，2min；95℃，15sec；58℃，20sec和72℃，20sec，共计40个循环。该体系下，PCR扩增产物均为单一峰值，无杂峰，表明不存在明显的引物二聚体或非特异PCR产物，而且整体曲线走势正常，表达稳定，符合实验要求。（3） PsARRO-1基因时空表达模式的探究：在试管苗生根过程中的10个不同时期，本研究分析了牡丹叶、茎、茎基部等3个器官中该基因的时空表达情况。结果表明，该基因在茎基部、茎、叶中均有不同程度的表达，说明PsARRO-1在牡丹中的表达具有明显的组织空间特异性。整体而言，茎的表达量最低，而且较平稳；叶只有在诱导培养的前10天大量表达；茎基部的表达量最高，且升降明显，出现两次峰值。这与该基因通过调节内源激素含量而调节不定根发生数量的推断相一致，说明其在不定根形成过程中起关键作用.