全基因测序发现ε-聚赖氨酸产生菌卡特利链霉菌具有两个大的线性复制子，包括一个新的、携带了丰富次生代谢物合成基因的1.8 Mb巨型质粒。ε-聚赖氨酸通常是由25~35个L-赖氨酸通过α-羧基和ε-氨基的酰胺键连接而成，是一种无毒害的新型生物防腐剂和天然材料。卡特利链霉菌染色体和质粒各编码一个ε-聚赖氨酸合成酶。为对接市场对单一聚合度ε-聚赖氨酸的产品需求，本项目拟以阐明ε-聚赖氨酸生物合成机制为切入点，对卡特利链霉菌进行基因组挖掘。一方面，通过产不同链长ε-聚赖氨酸的合成酶的比较分析、功能域置换和关键位点突变，解析ε-聚赖氨酸生物合成过程中控制聚合度的分子机制，人工构建产单一聚合度ε-聚赖氨酸的突变株。另一方面，鉴定卡特利链霉菌的新型端粒-末端蛋白系统，消除巨型线性质粒，以期提高工程菌的生长速度和发酵性能。

ε-Poly-L-lysine (ε-PL) is an antimicrobial homopolymer of L-lysine via isopeptide bond synthesized by the ε-PL synthetase (Pls), and can be used as a pollution-free food preservative. A short chain length ε-PL producer Streptomyces cattleya DSM46488 had been completely sequenced. Interestingly, two linear giant replicons were found in S. cattleya, of which a novel linear plasmid with the size of 1.8 Mb carries a large number of gene clusters for the potential production of secondary metabolites. Two homologous genes of NRPS-like Pls were idetnified in the individual replicons. In this proposal, I am elucidating the control mechanism of the degree of polymerization of ε-PL by genome mining of S. cattleya. Combinatorial and mutational analysis of the functional domains will be performed to the different ε-PL synthetases, which produced the ε-PL with diverse polymerization degrees. I will design and develop an engineered strain that is able to produce the ε-PL with the unique polymerization degree. In addition, if the giant plasmid could be cured from the strain, the small chromosome of S. cattleya may be a very interesting vehicle for the ε-PL biosynthesis.

以ε-聚赖氨酸产生菌卡特利链霉菌DSM46488为研究对象，结合分子遗传学、基因组学和生物信息学方法，研究了巨型质粒的复制机制和ε-聚赖氨酸的生物合成。主要研究结果包括：(i) 确定了1.8 Mb复制子pSCATT为单拷贝的线性质粒，在对该质粒复制过程的研究中识别了其中心复制起始区oriC2，确定了两个线性复制子的非典型端粒序列，鉴定了末端补平过程中所需的、新的末端蛋白-端粒相关蛋白，有助于消除巨型质粒和分析染色体与巨型质粒的进化关系。(ii) 基于ε-聚赖氨酸合成酶 (Pls) 保守序列与结构特征开发了Pls识别算法，在110个放线菌等不同种属的细菌基因组序列中预测到了113个Pls；通过基因敲除和在S. diastatochromogenes的Pls缺失突变株中异源表达等实验，证实了卡特利链霉菌质粒编码的PlsSCATT-p02920负责低聚合度ε-聚赖氨酸 (ε-PL) 的合成，而染色体编码的Pls没有产生ε-PL；对产长链和短链ε-PL的不同Pls缩合域进行交换组合，表明该域影响ε-PL的合成，多序列分析结果还表明Linkers区对ε-PL合成也很重要。(iii) 通过更新细菌毒素-抗毒素系统数据库TADB2及开发在线预测工具TAfinder，识别和鉴定了卡特利链霉菌II型的毒素-抗毒素系统relBE2sca，该系统为链霉菌中首例报道的RelBE家族毒素-抗毒素系统，并基于relBE2sca构建了遗传稳定的ε-聚赖氨酸合成酶表达质粒。这些工作将有助于研究卡特利链霉菌及其他重要链霉菌的基因组进化，阐明ε-聚赖氨酸生物合成过程中聚合度的控制机制。