克罗恩病（CD）属炎症性肠病,是疑难病症,国内发病率日趋上升。其发病机制尚不明确,研究表明TLR4/NF-κB通路与CD关系密切,miRNA-146a可负向调控TLR4信号通路。本课题前期工作证实艾灸治疗CD疗效肯定,在此基础上拟采用免疫组化、原位杂交、荧光定量PCR、miRNA芯片等技术,从基础和临床两方面进行研究,通过观察结肠TLR4、NF-κBp65、Myd88、TRAF6、IRAK1、IKK、IκBα、miRNA-146a的变化及隔药灸的干预作用,拟证实：调节TLR4/NF-κB通路中关键蛋白的表达,降低NF-κB活性,继而减少下游炎性因子的过度表达、减轻肠道炎症可能是隔药灸治疗CD的重要机制；隔药灸可能通过干预miRNA-146a的表达反馈调控TLR4/NF-κB信号通路。同时,基于CD与miRNA的关系有待阐明,本研究拟初步明确国人CD相关的miRNA及隔药灸对其的干预作用。

本研究采用免疫组化、Western Blot、荧光定量PCR、miRNA芯片、基因芯片等技术,从基础和临床研究隔药灸治疗克罗恩病（CD）的效应及作用机制。动物实验中,研究隔药灸对CD大鼠结肠TLR4/NF-κB通路及miRNA-146a的调控作用,并探讨大鼠CD相关miRNA表达谱及隔药灸的干预作用。结果表明,TLR4/NF-κB通路参与了大鼠CD的发生发展;隔药灸能减轻CD大鼠肠道炎症,促进组织损伤修复,降低血清和结肠TNFα、IL-1β表达;隔药灸能降低CD大鼠结肠TLR4蛋白及mRNA表达,抑制TLR4/NF-κB通路关键蛋白MyD88、IRAK-1、TRAF6、IKKα/β、NF-κB p65的表达,减少IκBα降解, 降低NF-κB的活性,从而抑制TLR4/NF-κB通路的传导,降低下游炎症因子的表达发挥炎症抑制作用,该作用可能是隔药灸治疗CD的重要机制。对miRNA的检测发现,CD大鼠结肠miRNA-146a增加,但隔药灸对其无明显干预作用；CD大鼠miRNA显著高于正常组的有81个,低于正常组有32个；隔药灸组高于CD模型组的有47个,低于模型组有36个；扩大样本进行部分miRNA验证,其中miRNA-147、miRNA-205得到验证,提示隔药灸调节大鼠CD可能与其调节炎症反应、BMP信号通路等相关。临床研究中,采用随机对照方法观察隔药灸为主治疗轻中度CD的临床疗效,检测TLR4、NF-？B p65的变化,探寻隔药灸治疗CD的miRNA核心调控靶点。结果表明,隔药灸为主治疗轻中度CD疗效确切,能显著降低患者CDAI评分,下调结肠TLR4、NF-？B p65表达,改善肠道炎症,促进组织损伤修复;CD患者和健康人有差异且隔药灸为主治疗后与治疗前有差异的肠黏膜miRNA 有33个(上调14个,下调19个)；差异mRNA 有1587个(上调225个,下调1362个)；差异miRNA靶基因预测得到上调基因968个,下调基因3656个。通过构建miRNA与mRNA表达负相关网络,发现hsa-miR-548m,hsa-miR-27a,hsa-miR-1205可能是隔药灸为主治疗CD产生疗效的miRNA核心调控分子。扩大样本进行靶基因验证,其中LIMK1,TBKBP1,TMEM30B得到验证,提示隔药灸调节CD可能与细胞周期、炎症反应和组织重建等生理病理过程相关。