本课题拟利用SSH技术寻找重茬地黄差异表达的基因，旨在基因转录水平上研究连作影响地黄生长发育过程的分子机理。本项目以地黄品种"温85-5"为试验材料，通过分别提取正茬（种植1年）与重茬（种植2年）地黄植株总RNA、反转录成cDNA、酶切、加接头、消减杂交、抑制性PCR、载体连接及转化等，建立以重茬地黄为检测对象的正向cDNA消减文库（含重茬中新表达的所有基因）和以头茬地黄为检测对象的反向cDNA消减文库（含重茬中被关闭的所有基因）。挑选阳性克隆进行测序，利用生物信息学理论和技术将测序的差异基因进行归类，判断不同基因序列代表的蛋白质及其功能；同时用定量PCR和Northern Blot的方法检查这些基因时空表达与重茬毒害的相关性，以初步确定响应重茬关键基因的候选名单。本研究为最终确证导致重茬毒害的关键基因、揭示地黄连作障碍的分子机制、解决我国中药材生产中的连作障碍难题奠定基础。

地黄连作障碍问题表现非常突出，其形成的分子机理尚不清楚。为探讨地黄连作障碍伤害的分子机理，本研究利用抑制性消减杂交（SSH）技术构建连作地黄的正反消减文库，通过蓝白筛选、PCR和斑点杂交的方法鉴定出阳性克隆，成功地构建了连作地黄cDNA消减文库，从正向和反向消减文库筛选、阳性克隆。测序分析后，从正库、反库分别获得232条、214条特异的EST序列；利用生物信息学技术，对这些序列进行了Nr、GO和COG功能预测，筛选了42个响应连作障碍的基因。利用qRT-PCR方法，分析了10个关键的基因的时空表达模式，初步构勒了地黄连作伤害的作用机理，其核心部分是钙信号的响应、感知和放大了化感物质信号，达到了课题计划的预期目标。本研究顺利找到了连作地黄体内特异表达的关键基因，为深入探讨地黄连作障碍成因、解读连作毒害的分子机理，开发消减连作危害的有效技术奠定了理论基础。