中文摘要
诱导多能性干细胞(iPS细胞)作为新型的干细胞在人类再生医学、家畜转基因育种、动物疾病模型等方面具有着巨大的应用潜力。人和小鼠的iPS细胞通过限定基因诱导成功，但牛的iPS细胞尚未见报道。本课题以逆转录病毒介导限定基因诱导牛体细胞重构为iPS细胞，研究牛限定基因的构建导入及建立牛iPS细胞的限定基因诱导体系，探讨牛iPS细胞体外稳定生长传代的培养体系；通过二倍体嵌合和四倍体互补技术检测牛iPS细胞的胚胎嵌合能力和iPS细胞嵌合胚胎的生长发育能力；研究牛iPS细胞Oct4和Nanog多能性基因启动子区域、生长发育关键基因H19和Igf2r的DNA甲基化状况，分析检测牛iPS细胞基因重构程度；利用牛iPS细胞进行体细胞核移植，比较牛iPS细胞与牛胎儿成纤维细胞核移植重构胚发育能力的差异。通过牛iPS细胞的诱导、培养、检测分析、鉴定等平台的建立，为牛iPS细胞作为转基因载体应用奠定基础。
结题摘要
牛iPS细胞的诱导培养研究对牛转基因育种、人源性疾病牛动物模型的制作和牛转基因乳腺生物反应器的生产和应用具有重要的意义。诱导形成的牛iPS细胞形态上类似于人的ES细胞集落，碱性磷酸酶染色为阳性，核型正常，表达干细胞特异性标记Oct4、Nanog、SSEA1等，流式细胞仪检测稳定表达细胞膜表面抗体SSEA1，体外能够自发分化形成三个胚层的组成细胞，体内分化形成具有三个胚层的畸胎瘤组织，牛iPS的Oct4和Nanog启动子甲基化检测处于激活的低甲基化状态，体外定向分化能够形成卵母细胞样细胞和卵泡复合物样结构，表达卵母细胞早期及晚期的特异基因Dazl、Vasa、Gdf9、ZP2和ZP3等，在蛋白表达卵母细胞特异性抗原标记Vasa和Nobox。牛iPS细胞的诱导、培养、鉴定、检测及定向分化等平台，可以为家畜iPS细胞在家畜转基因育种及动物模型制作等方面奠定基础。