中文摘要
盾叶薯蓣为我国所特有,已成为一种新型药物工业原料作物,其生产的薯蓣皂甙元是合成甾体激素类药物的最主要原料。环阿屯醇合成酶催化氧化鲨烯环化形成的环阿屯醇是薯蓣皂甙元生物合成途径中的重要反应之一,提高环阿屯醇合成酶基因的表达水平应可增加氧化鲨烯形成环阿屯醇的代谢流量,促进薯蓣皂甙元的生物合成。本项目利用植物环阿屯醇合成酶的氨基酸序列具有高度保守性的特点,通过设计简并引物、巢式PCR、RACE和功能筛选
结题摘要
以盾叶薯蓣总RNA为模板,用RT-PCR、巢式PCR和RACE PCR克隆出了编码环阿屯醇合成酶的全长cDNA,取名为DZCAS。DZCAS的功能通过在羊毛甾醇缺陷型的酵母细胞中表达和用高效液相色谱仪、液质联用仪分析酵母细胞中环阿屯醇的合成得到了证实。序列对比分析表明,盾叶薯蓣环阿屯醇合成酶与其它叶植物的环阿屯醇合成酶同源性达到70%以上。RT-PCR分析表明,DZCAS的表达水平在盾叶薯蓣的幼叶中最高,其次是在块茎,再次是在幼茎。建立了以愈伤组织为外植体、转基因效率为24.8%的农杆菌介导的盾叶薯蓣转基因技术。构建了DZCAS的植物表达载体,并用其转化培育盾叶薯蓣;筛选出了DZCAS表达水平高的转基因植株。生长分析和化学成分分析表明,超量表达DZCAS的转基因植株的块茎产量和薯蓣皂甙元含量与非转基因的无显著差异。另外,利用染色体步移法从盾叶薯蓣基因组中分别克隆出了盾叶薯蓣环阿屯醇合成酶基因5'端的调控序列(1.45 kb)和全长基因的一部分(2.6 kb);利用发根农杆菌诱导出了盾叶薯蓣毛状根,并得到了2个生长较快、薯蓣皂甙元含量较高的毛状根系。
