酪氨酸酶（EC 1.14.18.1）是一种酚类物质氧化酶，在果蔬、菌类的酶促褐变中起关键作用。明确双孢蘑菇酪氨酸酶基因家族的遗传背景，应用生物技术抑制该酶酶活以防止褐变是重要的研究热点。本研究拟对双孢蘑菇不同发育阶段、不同子实体组织进行基于RT-PCR的同源克隆，获得不同酪氨酸酶基因的cDNA片段，通过3'-RACE和5'-RACE获得各基因全长cDNA，对其进行分子生物学特性分析和系统发育学分析，揭示双孢蘑菇基因家族内的异质性；根据所得不同基因的特异序列分别设计探针，与子实体的不同发育时期、同一子实体不同部位的RNA进行Northern杂交，将杂交信号的强弱信息与对应的酪氨酸酶酶活进行匹配性比较，分析不同编码序列转录的时空异质性，找到引起双孢蘑菇褐变的关键基因；进一步，构建反义基因表达载体，导入农杆菌后，以农杆菌转染双孢蘑菇，对转化子进行相关鉴定后，评价反义基因对酪氨酸酶基因的抑制效果。

（1）以pBluescript KS II等3个质粒为过渡质粒，经过一系列的修饰、剪切和连接过程，将经典真菌表达质粒pCambia 1301 35S中正反向两个CaMV 35S启动子替换成GPD启动子，将CaMV 35S终止子替换为TrpC终止子，将GUS基因以GUS小片段替换，并在GUS小片段两侧分别插入酪氨酸酶基因铜离子结合位点(TYE-Cu2+)的正反义序列，最终形成以pCambia 1301 35S为基础的、由GPD启动的、通过大的发卡结构实现干涉功能的RNA干涉载体。将该载体转入农杆菌，侵染双孢蘑菇菌褶，经潮霉素筛选得到疑似转化子46株，经PCR验证为阳性。疑似转化子在不含潮霉素的平板上，生长速度亦明显慢于野生型，认为是RNA干涉元件发挥显著作用，影响了蘑菇菌丝的正常生长，进一步的遗传学分析在继续进行中。（2）设计同源引物，克隆了4条酪氨酸酶基因的cDNA序列，结合其它物种的相关信息，对该基因家族作了系统的生物信息学分析。（3）分别测定了双孢蘑菇菌柄、菌褶、菌盖内缘、菌盖内部、菌盖外缘等组织的酪氨酸酶酶活，结果显示在0.05水平，菌盖外缘的酶活显著高于其它组织。