肝细胞凋亡是造成肝脏损伤和肝脏疾病基本的中心环节，申请者在前期研究中发现凉血化瘀方具有明确的抗肝细胞凋亡作用。本项目在前期研究积累的基础上，重点在亚细胞和分子层面从内质网应激-线粒体途径对凉血化瘀方抗肝细胞凋亡作用机制进行深入研究，以期为肝细胞凋亡相关肝脏疾病提供作用机制明确、疗效切实可靠的治法方药；为相关中药创新药物研制奠定基础。研究方案如下：（1）建立肝损伤动物及细胞模型；（2）分别检测内质网应激和线粒体途径细胞凋亡标志蛋白GRP78，caspase12等和Cyt-C、AIF、caspase9等，研究凉血化瘀方调控内质网应激和线粒体途径细胞凋亡机制和作用靶点；（3） 动态检测Ca2 +变化，并检测内质网应激与线粒体途径交互作用的桥梁蛋白Bcl-2等，分折凉血化瘀方对内质网应激与线粒体途径交互作用的调节机制；（4）基于医学生物信息学的方法，分析数据间相互作用及与药效学之间的关系。

线粒体和内质网在调节肝细胞凋亡过程中发挥着关键作用，凉血化瘀方拮抗TNF-α和D-GalN诱导肝细胞凋亡的作用机制与线粒体、内质网介导的凋亡通路密切相关，本研究从这两条途径探讨凉血化瘀方对肿瘤坏死因子α（TNF-α）和D-氨基半乳糖 (D-GalN)所致肝细胞凋亡的保护作用。研究发现，不同浓度的凉血化瘀方作用后，与TNF-α/GalN损伤组相比，可显著减轻L02肝细胞的增殖抑制、减少细胞的凋亡，抑制细胞线粒体跨膜电位的下降，并使促凋亡蛋白Apaf-1、AIF、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9的表达量呈逐渐下降的趋势，同时可抑制细胞质内游离钙离子含量的增高，并使磷酸化PERK、磷酸化elF2α、cleaved caspase-12、GRP78、CHOP的蛋白表达量呈逐渐下降的趋势。这些发现说明：凉血化瘀方对TNF-α和D-GalN所诱导的肝细胞凋亡具有抑制作用，其机制可能是通过稳定细胞线粒体的跨膜电位、维持细胞钙稳态平衡，干扰线粒体和内质网凋亡关键蛋白Apaf-1、AIF和caspase蛋白酶的表达，抑制PERK、elF2α蛋白的磷酸化及下调凋亡相关因子GRP78、CHOP、cleaved Caspase-12的表达而实现的。